Адаптивный иммунный ответ у пациентов с кальцинозом коронарных артерий

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смертности во всём мире, в России эта цифра составляет более 50%. При этом в структуре смертности от болезней системы кровообращения ишемическая болезнь сердца (ИБС) составляет 54,6% [1]. Основным фактором риска развития ИБС остается атеросклероз [2]. Атеросклероз  — мультифакторное заболевание, характеризующееся полиэтиологичностью, где завершающей стадией развития выступает формирование атеросклеротической бляшки, с развитием локальных участков кальцификации интимы. Учитывая, что наиболее распространённой теорией возникновения атеросклероза является реакция на повреждение, с активацией первичного иммунного ответа (врожденного), а затем и приобретённого или адаптивного [3], интересным представляется изучение показателей иммунного ответа у пациентов с доказанным коронарным кальцинозом для более детального понимания участия иммунокомпетентных клеток в кальцификации коронарных артерий. Известно, что ИБС и её осложнения приводят к развитию инвалидизации населения. В связи с этим на протяжении многих десятилетий создаются различные инструменты прогнозирования фатальных осложнений ИБС, однако единого инструмента стратификации риска в настоящий момент не существует. Возможно, это связано с мультифакторностью атеросклероза, например, не только наличие факторов риска, сопутствующей патологии, но и вовлечение иммунного ответа в его прогрессирование. Стремительное развитие методов лучевой диагностики и других визуализирующих методик позволяют находить новые маркеры прогноза неблагоприятного исхода ИБС. Наибольшее распространение получил метод мультиспиральной компьютерной томографии коронарных артерий с расчётом коронарного индекса по методике Агатстона, прогнозирующий риск коронарных событий [4]. Данная методика применялась в различных рандомизированных, популяционных, наблюдательных исследованиях, например, ROBINSCA, MESA, RECALL study, Rotterdam, показавшие высокую прогностическую роль коронарного индекса, позволившего с большей точностью рассчитать риск возникновения осложнений коронарного атеросклероза [5-7].

Цель исследования — изучение и оценка состояния адаптивного иммунного ответа у пациентов с кальцинозом коронарных артерий в зависимости от коронарного индекса, рассчитанного при проведении СКТ коронарных артерий.

Материалы и методы

Данное исследование проводилось в ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России в рамках государственного задания Минздрава России. В исследование были включены пациенты с коронарным атеросклерозом, которым проведена мультиспиральная компьютерная томография, синхронизированная с ЭКГ, рассчитан коронарный индекс (КИ) по методике Агатстона, где низкий риск — 0–10 ЕД., умеренный риск — 11–100 ЕД., высокий риск — 101–400 ЕД., очень высокий риск — ≥401 ЕД [8]. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом.

В исследовании приняли участие 62 пациента мужского пола, из них 20 человек с коронарным атеросклерозом — соответствующие группе умеренного риска (I группа), 20 человек с коронарным атеросклерозом — соответствующие группе высокого риска (группа 2) и 22 человека добровольцев (контроль), у которых нет клинических и инструментальных признаков коронарного атеросклероза по данным СКТ коронарных артерий, сопоставимых по возрасту (55,2±1,7; 56,9±1,3 и 52,7±1,1 соответственно, р мн.=0,34). Пациенты обеих групп имели следующие факторы риска атеросклероза – курение, артериальная гипертензия. Из фармакологического анамнеза – обе группы пациентов не принимали гиполипидемические препараты. Критериями исключения были сахарный диабет, онкопатология, заболевания соединительной ткани, хронические вирусные инфекции. Всеми участниками исследования было подписано добровольное информированное согласие на участие и проведение необходимых исследований. С целью рандомизации групп была проведена спиральная компьютерная томография (СКТ) коронарных артерий и аорты (спиральный компьтерный томограф Revolution EVO, GE Healthcare) пациентам, которым определены показания для этого исследования. Оценка коронарного кальция (КК) и расчёт индекса Агатстона проведены с помощью программного приложения для расчёта коронарного кальция Smart Score. Для определения количественного состава лимфоцитов с помощью метода проточной лазерной цитофлюориметрии проводили фенотипирование популяций CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+ с расчётом иммуно-регуляторного индекса. Для исследования Гранзим B+ из периферической крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина выделяли мононуклеарные клетки, которые пермеабилизировали Intra Prep Permeabilization Reagent (Immunotech) с последующим окрашиванием моноклональными антителами к Гранзим В (Serotec). На проточном цитофлюориметре Cytomics FC 500 (Beckman Coulter) выполняли анализ образцов. Исследование В-лимфоцитов (CD19+) проводили с помощью проточной цитофлюориметрии (Cytomics FC 500, Beckman Coulter) с использованием соответствующих моноклональных антител. Количественное определение уровня Ig А, М, G проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле с использованием наборов моноспецифических антисывороток, содержащих антитела к тяжёлым цепям соответствующих иммуноглобулинов (ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, Россия). Результаты выражали в г/л. Для определения циркулирующих иммунных комплексов применяли метод преципитации сыворотки в полиэтиленгликоле. Учёт результатов осуществляли на спектрофотометре при длине волны 450 нм, выражали в условных единицах. Статистический анализ результатов исследования проводили с применением программы Statistica 12.0 (StatSoft, США). Показатели в группах представлены медианой с межквартильным диапазоном и средним выборочным значением со стандартной ошибкой. Нормальность распределения значений в выборках проверяли по критерию Шапиро-Уилка. Для сравнения показателей в трёх группах использовали дисперсионный анализ и критерий Краскела-Уоллиса. При попарном сравнении вводили поправку на число сравниваемых групп по Тьюки.

Результаты

Как уже упоминалось выше, для уточнения изменений в иммунном статусе респондентов, пациенты с атеросклерозом были распределены на две группы: I группа — с КИ 11–100 ЕД., II группа — с КИ 101–400 ЕД. При этом медиана (Ме) КИ в I группе составила 33 ЕД., во II группе — 262 ЕД., значение р=0,0001, что свидетельствует о статистически значимой разнице КИ в обеих группах. При этом в группе контроля КИ составил 0 ЕД. В таблице 1 представлено проведение сравнительного анализа в группах с атеросклерозом, где отмечается значимо большее содержание относительного числа CD3⁺-лимфоцитов, но при этом I и II группы по данному показателю между собой не различались. При оценке субпопуляций Т-лимфоцитов не выявлено статистически значимых изменений в содержании CD3⁺CD4⁺ и CD3⁺CD8⁺ лимфоцитов, что закономерным образом не привело к изменению иммуно-регуляторного индекса ни в сравнении групп между собой, ни в сравнении с группой контроля. Однако обращает внимание повышение цитотоксического потенциала CD3⁺CD8⁺ лимфоцитов во II группе по сравнению с группой контроля и с I группой.

При проведении сопоставительного анализа показателей гуморального звена адаптивного иммунитета повышение относительного содержания субпопуляции В-лимфоцитов отмечено во II группе по сравнению с группой контроля и I группой, в то время как в I группе наблюдается лишь тенденция к увеличению, не достигая статистической значимости. Функциональная активность CD19⁺ лимфоцитов проявлялась в гиперглобулинемия класса А в обеих группах пациентов с атеросклерозом, при этом значимо содержание данного иммуноглобулина между I и II группой не различались. Не выявлено различий в исследуемых группах по содержанию иммуноглобулинов классов М, G и циркулирующих иммунных комплексов (табл. 2).

Обсуждение

Необходимо отметить, что развитие кальцификации коронарных артерий связано с прогрессированием атеросклероза, в связи с чем отмечается преимущественно интимальное отложение кальция с вовлечением воспалительных клеток иммунного ответа. Под действием цитокинов происходит дальнейшая фенотипическая модуляция гладко-мышечных клеток в хондроцитоподобные клетки, что приводит к формированию участков кальцификации в атеросклеротически измененных артериях [9]. Данные, полученные нами при оценке клеточного состава адаптивного иммунитета, сопоставимы с результатами авторов Farias-Itao D. и соавт., показавшими большее содержание CD3⁺ лимфоцитов у пациентов с атеросклерозом. Причём, чем более выраженным был атеросклероз, тем большее содержание клеток было отмечено в зоне коронарного кальциноза [10]. Авторами также регистрировалось большее содержание CD8⁺ лимфоцитов и отсутствие колебаний в содержании CD4⁺ лимфоцитов. В нашем исследовании мы не отметили повышения содержания CD8⁺ лимфоцитов, что, возможно, связано с определением их в циркулирующей крови, а не в местах формирования атеросклеротической бляшки. Но при этом чётко отмечается поляризация CD8⁺ лимфоцитов по цитотоксическому типу, о чём свидетельствует большее содержание внутриклеточного гранзима В. Данный факт отражается и в работах других авторов, что при коронарном кальцинозе может иметь прогностическое значение [11]. Повышенный уровень CD3⁺ лимфоцитов, без существенного изменения CD4⁺ и CD8⁺ субпопуляций является неоднозначным, и может свидетельствовать о перераспределении клеток в тканях и системном кровотоке.

При анализе гуморального звена выявленное повышение В-лимфоцитов и гиперпродукция иммуноглобулина А, возможно, ассоциировано с более тяжёлым коронарным кальцинозом, что находит отражение и в Роттердамском исследовании, в котором приняли участие более 8 тыс. пациентов, где повышенный уровень иммуноглобулина А был напрямую связан с коронарным кальцинозом, высоким сердечно-сосудистым риском и наибольшие его значения наблюдались с КИ более 400 ЕД [12].

Заключение

Таким образом, выявленные изменения в адаптивном иммунном ответе у пациентов с коронарным кальцинозом свидетельствуют о его активации, в частности цитотоксического потенциала и функциональной активности В-клеток, что является основой для дальнейших исследований иммунного ответа с разработкой универсального скринингового инструмента.