Возможные маркеры ожирения, связанные с микробиомом кишечника

Введение

Ожирение — это сложное нарушение обмена веществ, вызванное различными генетическими и негенетическими факторами. Распространённость данной патологии ежегодно увеличивается. Прогнозируется, что к 2030 г. число людей с ожирением во всём мире достигнет 1,12 миллиарда [1]. Ожирение проявляется не только изменениями внешнего вида, оно также связано с нарушениями липидного и углеводного обменов, хроническим воспалением и повышенным риском неинфекционных заболеваний, в первую очередь сердечно-сосудистых, сахарного диабета 2 типа и некоторых видов рака [2]. Этиология ожирения на сегодняшний день является важным направлением исследований. Недостаточное понимание патогенеза остается серьёзным препятствием к успешному лечению данного заболевания. Глобальная эпидемия ожирения стимулировала усилия учёных по выявлению новых факторов, влияющих на энергетический баланс. Несмотря на то, что пребиотики, пробиотики и антибиотики десятилетиями использовались в качестве модуляторов роста в экспериментах на животных, только недавно внимание исследователей привлекла взаимосвязь между составом кишечного микробиома, его изменением и ожирением. Появляется всё больше доказательств того, что дисбаланс микробиома/микробиоты кишечника может быть фактором, приводящим к ожирению [3][4]. Изменения в таксономическом составе микробиома кишечника способствуют более интенсивному извлечению калорий из пищи, снижению секреции гормонов, подавляющих аппетит (глюкагоноподобный пептид 1 типа (GLP-1), PYY и лептин) и чувства насыщения, а также нарушению целостности кишечного барьера, что приводит к проникновению эндотоксинов (липополисахаридов) в кровяное русло и воспалению, что в совокупности способствует развитию ожирения [5]. В макроорганизме человека обитает около 100 триллионов штаммов микроорганизмов, включающих более 10 000 видов, которые поддерживают симбиотические отношения с макроорганизмом. У взрослого человека микробиом кишечника в основном представлен двумя филумами: 79,4% Bacillota и 16,9% Bacteroidota, а также небольшим количеством Actinomycetota (2,5%), Pseudomonadota (1%) и Verrucomicrobiota (0,1%) бактерий [6]. Это эволюционное мутуалистическое партнёрство между макроорганизмом и микробиомом обеспечивает подавление условно-патогенных микроорганизмов, поддержание целостности эпителия кишечника, регуляцию иммунной функции, а также влияет на метаболизм макроорганизма путём выработки метаболически активных веществ, таких как короткоцепочечные жирные кислоты, метаболиты желчных кислот и различных витаминов [7]. Есть данные о том, что изменение разнообразия микробиома кишечника и количества определенных микробных таксонов связано с ожирением и метаболическими нарушениями. В настоящее время не обнаружено универсального микроорганизма, приводящего к развитию ожирения, но в различных исследованиях наблюдались ассоциации индекса массы тела (ИМТ) с некоторыми видами бактерий, включая E.coli, A.muciniphila, F.prausnitzii и L.reutery и др. Так, для E.coli выявлена обратная связь с ожирением, а для L.reutery — положительная, в то время как F. prausnitzii и A. muciniphila менее распространены у пациентов с ожирением [8][9]. Однако результаты большинства исследований по изучению взаимосвязи микробиома кишечника с ожирением разнонаправлены и противоречивы. Но, несмотря на это, большинство исследователей, занимающихся данной проблемой, приходит к консенсусу о перспективах использования микробиома кишечника в качестве терапевтической мишени для лечения ожирения. Таким образом, дальнейшее изучение взаимосвязи между конкретными бактериями и ожирением, может быть использовано для профилактики и лечения данного заболевания в будущем.

Цель исследования — изучить особенности таксономического состава микробиома кишечника на уровне некоторых бактериальных видов у пациентов с ожирением и у здоровых людей с нормальной массой тела.

Материалы и методы

Когортное исследование проведено на базе ФГБОУ ВО РостГМУ МЗ РФ, ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» и Центра цифровой и трансляционной биомедицины ООО «Центр молекулярного здоровья», одобрено ЛНЭК ФГБОУ ВО РостГМУ (протокол № 20/19 от 12.12.2019). С целью уменьшения воздействия климатических, этнографических факторов и особенностей пищевого рациона на микробиоту кишечника в работу были включены жители одной территории (Ростовская область). В исследование вошли 265 человек (221 (83,4%) женщина, 44 (16,6%) мужчины), средний возраст обследуемых — 47,1±4,8 лет. Критерии включения: подписанное информированное согласие на участие в исследовании, ИМТ≥18,5кг/м², возраст старше 18 лет, отсутствие в анамнезе использования антибиотиков, пребиотиков и пробиотиков за 3 месяца до начала исследования. Критерии исключения: беременность, депрессия, соматические заболевания тяжёлой степени, бариатрические операции, патология желудочно-кишечного тракта. В первую (контрольную) группу были включены 129 человек: 114 (88,3%) женщин, 15 (11,6%) мужчин, средний возраст обследуемых — 39,6±4,2 года, средний показатель ИМТ — 20,8±2,1 кг/м², ОТ — 74±5,8 см. Во вторую группу вошли 136 пациентов с ожирением: 28 (20,6%) мужчин, 108 (79,4%) женщин, средний возраст — 54,6±4,7 года, среднее значение ИМТ — 33,8±3,36 кг/м², ОТ — 99,7±7,3 см. Все вошедшие в исследование были осмотрены, у них собрали жалобы и анамнез, а также определены рост, масса тела и окружность талии (ОТ). ИМТ рассчитывали по рекомендациям экспертов ВОЗ (2003). Значение окружности талии определяли сантиметровой лентой на уровне середины расстояния между рёберными дугами и гребнями подвздошных костей. Ручным тонометром по стандартной методике Н.С. Короткова выполняли измерение артериального давления. Определение состояние углеводного обмена включало исследование глюкозы плазмы натощак (ГПН), иммунореактивного инсулина и расчёт индекса инсулинорезистентности (глюкоза натощак (ммоль/л) × инсулин натощак (Ед/л)/22,5). С целью исключения дислипидемии всем обследуемым определялся уровень холестерина липопротеидов низкой (ХС ЛПНП), липопротеидов высокой плотности (ХС ЛПВП) и общего холестерина (ОХС), а также триглицеридов (ТГ) в сыворотке крови. Уровень инсулина исследовался на анализаторе «Mag pix» («BioRad») с использованием набора «Milli plex: Human Adipokine Magnetic Bead Panel 2». На спектрофотометре «Hitachi U-2900» с наборами реагентов «Ольвекс Диагностикум» проводили биохимические исследования. Образцы фекалий получали согласно рекомендациям¹. Композиционный состав кишечного микробиома выполняли в условиях Междисциплинарного центра коллективного пользования КФУ путем метагеномного анализа. Из образцов фекалий ДНК макроорганизмов выделяли с использованием набора «QIAamp DNA stool mini kit» («Qiagen»). На платформе «Illumina MiSeq» проводили секвенирование вариабельного участка v3–v4 гена 16S рРНК. Программой «QIIME v.1.9.1» с использованием референсной базы данных «Greengenes v.13.8» с 97%-ным порогом сходства между последовательностями были проанализированы выявленные последовательности генов 16S рРНК. Относительная представленность бактериальных таксонов в общем пуле ридов указана в долях (от 0 до 1), которые были рассчитаны на основе количества картированных ридов для каждого таксона. В R-версии программы «RStudio v.3.2» выполняли статистические расчеты. С помощью теста Шапиро-Уилка проведена проверка данных на нормальность распределения. Для количественных показателей рассчитаны средние ± средние квадратические отклонения; медиана и квартили (25%, 75%), минимальные и максимальные значения в выборке. Сравнение средних уровней в группах проводилось с помощью теста Манна-Уитни, частот (%) — с помощью точного теста Фишера. Сравнение частот обнаружения микроорганизмов, верифицированных в толстой кишке, в группах проводилось с помощью точного теста Фишера с поправкой на множественные сравнения по Холму. Сравнение медиан количественных характеристик изучаемых микроорганизмов, верифицированных в толстой кишке, в группах проведено с помощью теста Крускала-Уоллиса (попарные апостериорные сравнения — по методу Неменьи). При р<0,05 различия признавали статистически значимыми. Работа написана по материалам диссертации «Фенотипы ожирения и их связь с микробиомом кишечника и эндокринной функцией жировой ткани»

Результаты

Обследованные (n=265) были разделены на две группы: I группа (n=129) — контрольная, II группа (n=136) — пациенты с ожирением. Средний возраст лиц контрольной группы был значимо меньше (p<0,05) аналогичного показателя у пациентов с ожирением. Между группами статистически значимые различия выявлены для ОТ, ИМТ и артериального давления с повышением их значений во II группе. Помимо этого, у пациентов с ожирением уровень ГПН, инсулина, индекса HOMA-IR и значение ТГ были выше (p=0,007, p=0,001, р=0,001, р=0,02 соответственно) по сравнению со здоровыми лицами. При этом во II группе уровень ХС ЛПВП был ниже по сравнению с обследуемыми контрольной группы. По уровню ОХС (р=0,40) и ХС ЛПНП (р=0,20) обе группы были сопоставимы. Сравнение клинико-лабораторных показателей пациентов I и II групп представлено в табице. 1.

При сравнении частот обнаружения отдельных видов микроорганизмов (рис. 1) выявлено, что Faecalibacterium prausnitzii регистрировали у 100,0% обследуемых обеих групп. Также в микробиоме кишечника преобладали такие виды, как Prevotella copri (98,0% в I группе, 100,0% во II группе), Bifidobacterium adolescentis (92,0% в I группе, 97,0% во II группе) и Akkermansia muciniphila (79,0% в I группе, 84,0% во II группе). Частоты обнаружения Lactobacillus reuteri (р=0,04) и Lactobacillus ruminis *(р=0,04) статистически значимо были повышены у пациентов с ожирением.

Анализ количественных показателей (табл. 2) выявил значимые отличия для 4 видов микроорганизмов, а именно: для F. prausnitzii, P. сopri, B. adolescentis, B. longum. У пациентов с ожирением в кишечном микробиоме были снижены показатели у F. prausnitzii (р=0,02), B. adolescentis (р=0,002) и B. longum (р <0,0001), но повышены у P. сopri (р=0,02).

Таким образом, полученные результаты продемонстрировали определённые видовые отличия в микробиоме кишечника у здоровых лиц и у пациентов с ожирением.

Обсуждение

При анализе отдельных видов микроорганизмов у здоровых лиц и пациентов с ожирением во всех случаях в микробиоме кишечника были обнаружены F. prausnitzii, также преобладали виды A. muciniphila, B. adolescentis и P. copri. Были выявлены качественные и количественные различия отдельных видовых паттернов бактерий в обследуемых группах. Так, по признаку частот обнаружения значимые отличия выявлены для L. reuteri и L. ruminis, которые чаще регистрировали у пациентов с ожирением. Что согласуется с результатами других исследователей [10]. Анализ количественных показателей показал значимые отличия для 4 видов (B. adolescentis, B. longum, P. сopri, F. prausnitzii). У пациентов с ожирением в микробиоме кишечника были снижены B. adolescentis (р=0,002), B. longum (р<0,0001), F. prausnitzii (р=0,02) и повышены P. сopri (р=0,02) по сравнению с аналогичными показателями обследуемых контрольной группы. По данным литературы, F. prausnitzii (филум Bacillota) оказывает противовоспалительное действие на желудочно-кишечный тракт путем продукции бутирата и подавления уровня провоспалительных цитокинов, поэтому уменьшение количества данного вида бактерий в микробиоме кишечника может быть опосредованно связано с состоянием ожирения [11][12]. Более низкое содержание F. prausnitzii в микробиоме кишечника пациентов с ожирением, обнаруженное в данной работе, согласуется с результатами других авторов [13][14]. Однако есть исследования, которые не выявили разницы в содержании F. prausnitzii при ожирении и нормальной массе тела [15]. Более низкий уровень B. adolescentis и B. longum, относящихся к филуму Bacillota, у пациентов с ожирением также был описан некоторыми исследователями [16]. В частности, Torres-Fuentes С. et al. предположили, что основные механизмы влияния бифидобактерий на снижение массы тела человека могут быть связаны с уменьшением содержания орексигенного гормона грелина, поскольку было обнаружено, что B. longum ослабляет грелинергическую передачу сигналов in vitro [17]. Противоположные результаты были получены в отношении количества Р. copri, уровень которого в нашем исследовании у пациентов с ожирением был статистически значимо выше по сравнению со здоровыми лицами без ожирения, что также было обнаружено и в других работах [18]. Есть данные, что транскриптоны толстой кишки, жировой ткани и мышц у мышей, колонизированных P. copri, сопровождались активацией хронической воспалительной реакции макроорганизма через сигнальные пути TLR4 и mTOR и значительным увеличением экспрессии генов, связанных с липогенезом и накоплением жира, но ослаблением экспрессии генов, связанных с липолизом [10][19]. В нашем исследовании отсутствовали статистически значимые различия в содержании A. muciniphila у пациентов с ожирением и у здоровых лиц без ожирения. При этом большинство имеющихся на сегодняшний день данных выявило обратную корреляцию между уровнем A. muciniphila и ИМТ [20]. Механизмы, с помощью которых A. muciniphila может влиять на массу тела, полностью не изучены. A. muciniphila — муциндеградирующая бактерия, относится к филуму Verrucomicrobiota, обеспечивая целостность кишечного барьера и сохранения таксономического состава микробиома кишечника в состоянии эубиоза, что способствует удержанию нормальной массы тела [21]. Также есть данные, что A. muciniphila способна усиливать термогенез и секрецию глюкагоноподобного пептида-1 и снижать экспрессию белков, участвующих в дифференцировке адипоцитов, а также экспрессию генов переносчиков глюкозы и фруктозы в тощей кишке, тем самым снижая всасывание углеводов [22][23]. Помимо этого, в одном из исследований было выявлено, что у пациентов, перенесших бариатрическую операцию (шунтирование желудка по методу Ру-эн-У) наблюдалось увеличение количества A. muciniphila наряду с улучшением антропометрических и клинических показателей, таких как снижение ИМТ, а также повышение уровня GLP-1 [20].

Увеличение количества лактобактерий, относящихся к филуму Bacillota, обычно, связывают с ожирением [24]. Среди бактерий этого рода Lactobacillus reuteri [5] коррелирует с более высоким ИМТ, что было выявлено и в нашем исследовании. Однако некоторые виды лактобактерий (Lactobacillus paracasei и Lactobacillus plantarum), наоборот, способствуют снижению массы тела благодаря выработки бактериоцинов, которые препятствуют росту патогенов, вызывающих дисбиоз [25]. Эти данные свидетельствует о том, что бактерии даже одного и того же вида могут оказывать противоположные эффекты на энергетический гомеостаз. Многочисленные исследования, в которых сравнивался микробиом кишечника у пациентов с ожирением и у здоровых лиц, выявили значительные изменения в его составе не только на уровне отдельных видов бактерий, но и на уровне филумов. При ожирении, по данным большинства исследований, наблюдается уменьшение количества бактерий типа Bacteroidota и увеличение количества бактерий типа Bacillota [10]. Так, соотношение Bacillota/Bacteroidota было значительно выше в группе с ожирением и более чем в два раза превышало значение в группе обследуемых без ожирения. Однако другие авторы выявили обратную зависимость, то есть более низкий уровень Bacteroidota и более высокий — Actinomycetota без существенной разницы в Bacillota у пациентов с ожирением [26], в то время как в других исследованиях не удалось выявить корреляцию между ИМТ и соотношением Bacillota/Bacteroidota [27]. Считается, что повышенное соотношение Bacillota/Bacteroidota у людей с ожирением приводит к более эффективному гидролизу углеводов в кишечнике и увеличению количества получаемых калорий из продуктов питания [28]. По результатам нашего исследования, у пациентов с ожирением для филума Bacteroidota регистрировали статистически значимо более высокий уровень (p<0,05), а для Bacillota и Actinomycetota — более низкий (p<0,05) [29]. Наличие расхождений в результатах проведённых исследований может быть вызвано множеством факторов, такими как методы, используемые для анализа микробиома кишечника, разной конструкцией праймеров и разными методами выделения ДНК отличаться характеристиками исследуемой популяции (особенности пищевого рациона, пол, географическое расположение, этническая принадлежность и сезон). Поскольку микробиом кишечника подвержен влиянию различных факторов внешней и внутренней среды и трудно контролировать все элементы, влияющие на его состав, что, безусловно, усложняет изучение микробиома кишечника при ожирении. Тем не менее, результаты большинства исследований, нашего в том числе, показывают, что при ожирении формируется особый состав микробиома кишечника, отличный от микробиома здоровых лиц без ожирения.

Заключение

Эффективное лечение ожирения по-прежнему остаётся важной социальной и медицинской потребностью. Имеющиеся на сегодняшний день данные подтверждают предположение о том, что микробиом кишечника является ещё одним важным фактором в и без того в сложном и длинном списке причин, влияющих на развитие ожирения. На данный момент общепризнанным является тот факт, что ожирение не вызывается каким-то одним видом бактерий, но определяется нарушением экологического баланса микробиома кишечника. Однако степень влияния микробиома кишечника на увеличение массы тела у людей до сих пор не определена, что требует дальнейшего изучения. Результаты данного исследования свидетельствуют о том, что в микробиоме кишечника при ожирении наблюдаются некоторые видовые отличия, что связано с повышенным уровнем P. сopriи и сниженным уровнем F. prausnitzii, B. adolescentis и B. longum.