Корреляции цитокинов, регулирующих синтез структурных макромолекул соединительной ткани при недифференцированной дисплазии соединительной ткани у девочек-подростков

Введение

Многообразие клинических проявлений и полисистемность поражения при дисплазии соединительной ткани (ДСТ), высокая её распространённость среди лиц молодого возраста позволяет рассматривать данное заболевание в качестве актуальной медико-социальной проблемы. Благодаря исследованиям последних лет были уточнены многие патогенетические и фенотипические аспекты дисплазии соединительной ткани, разработаны подходы к диагностике, лечению и профилактике отдельных форм диспластических синдромов [1][2]. В настоящее время принято разделение ДСТ на 2 группы: дифференцированные и недифференцированные. К недифференцированным формам ДСТ (НДСТ) относится генетически гетерогенная группа нозологических форм, связанных с развитием многочисленных хронических заболеваний, набор клинических признаков которых не укладывается ни в одно из наследственных моногенных заболеваний [3].

Следует отметить высокую актуальность дисплазии соединительной ткани в подростковом возрасте. В настоящее время к группе риска по нарушению функции репродуктивной системы относят девочек-подростков с наличием НДСТ [4–6]. Гормональные нарушения, сопровождающие течение НДСТ, способствуют формированию у данных лиц нарушений менструального цикла (НМЦ), к которым относятся раннее менархе, маточные кровотечения, гипоменструальный синдром [7].

Необходимо указать, что особенности регуляторного звена иммунной системы при дисплазиях соединительной ткани остаются мало изученными и не теряют своей актуальности. При этом одним из множества эффектов, оказываемых цитокинами на те или иные ткани и органы-мишени, является также регуляция синтеза структурных макромолекул соединительной ткани. В частности, это опосредуется путем воздействия на клетки-источники соединительнотканных волокон. Так, фактор некроза опухолей-α (TNF-α) обладает антифибротической активностью, запуская понижающую регуляцию рецептора трансформирующего фактора роста-β II типа в фибробластах кожи человека, что приводит к десенсибилизации фибробластов кожи человека к данному фактору [8]. Кроме того, показано, что фибробласты кожи и лёгких в присутствии TNF-α демонстрируют антифибротический ответ, что заключается в снижении синтеза коллагена I типа [9]. Интерлейкин (IL) -1α индуцирует провоспалительные реакции фибробластов и подавляет выработку экстрацелюллярного матрикса (коллаген, фибронектин, периостин), а также способность клеток восстанавливать фибриллярный коллаген I [10]. IL-6 приводит к снижению клеточной пролиферации и увеличению апоптоза и дифференцировки первичных склеральных фибробластов человека, играя роль в ремоделировании склеры в миопических глазах [11]. Следует отметить, что миопия является одним из фенотипов НДСТ [12]. С другой стороны, есть данные, что IL-6 наряду с трансформирующим фактором роста-β может повышать уровни экспрессии коллагена первого типа и фибронектина миофибробластами, играя таким образом профибротическую роль [13]. В свою очередь несколько исследований показало, что IL-4 является основным профибротическим цитокином, который стимулирует синтез коллагена фибробластами. В ответ на in vitro стимуляцию интерлейкином-4 фибробластов кожи человека наблюдается повышение уровней коллагена I и III типов и фибронектина [14]. Значительно более высокие уровни IL-4 обнаружены в образцах биопсии кожи, культурах дермальных фибробластов и сыворотках пациентов с системным склерозом [15]. При заживлении кожных ран IL-4 способствует хемотаксису и пролиферации фибробластов, дифференцировке миофибробластов и продукции коллагена и макромолекул экстрацелюллярного матрикса [16]. IL-10, не оказывая прямого влияния на фибробласты, индуцирует макрофаги М2 к секреции факторов, усиливающих пролиферацию фибробластов [17]. IL-17A также выступает в качестве профибротического цитокина и играет ключевую роль в фиброзном процессе различных органов, таких как лёгкие, почки, сердце и кожа [13]. Наконец, цитокиновая система RANK/RANKL/OPG (активатор рецептора ядерного фактора κВ / лиганд активатора рецептора ядерного фактора κВ / остеопротегерин) регулирует ремоделирование кости, как специализированной формы соединительной ткани, воздействуя на функции остеокластов [18].

Существуют работы, посвящённые цитокиновому статусу при ДСТ у лиц различного пола и возраста, подтверждающие одну из ключевых ролей цитокиновой регуляции в нормальном коллагеновом обмене и минерализации костного вещества [19][20]. Тем не менее, сведений о взаимосвязи синтеза различных цитокинов, регулирующих синтез структурных макромолекул соединительной ткани, при НДСТ с НМЦ у девочек-подростков в доступной литературе нами обнаружено не было.

Цель исследования — изучить корреляционные связи сывороточных уровней цитокинов, регулирующих синтез структурных макромолекул соединительной ткани, при НДСТ у девочек-подростков с НМЦ.

Материалы и методы

Работа выполнена в Донецком Национальном медицинском университете. Обследовано 176 девочек-подростков с НМЦ в сочетании с НДСТ в возрасте от 11 до 17 лет (среднее значение — 14,0±0,15 лет), которые составили группу сравнения. В контрольную группу вошли 69 девочек-подростков аналогичного возраста без НДСТ и НМЦ (среднее значение — 14,0±0,25 лет).

При постановке диагноза НДСТ руководствовались критериями Т. Милковска-Димитровой. Диагноз выставлялся при наличии двух больших критериев (гипермобильность суставов, артралгии более 3 месяцев невоспалительного и нетравматического характера) или одного большого и двух малых. К малым критериям относятся марфаноидный фенотип, повторяющиеся вывихи в одном суставе или вывих/подвывих более чем 1 сустава, характерные изменения кожи (симптом «папиросной бумаги», «растяжимая кожа», «тонкая кожа»). У обследуемых отмечались нарушения менструального цикла, которые заключались в раннем наступлении менархе, гипоменструальном синдроме, симптомах дисменореи, а также маточных кровотечениях пубертатного периода.

Из исследования исключали лиц с наличием эндокринных и метаболических расстройств (тиреоидит, сахарный диабет и др.), хронических заболеваний печение и почек, гематологических и психических заболеваний, неопластических состояний, аутоиммунной патологии (системные заболевания соединительной ткани, ревматизм и др.), хронических воспалительных заболеваний, а также лиц, принимающих противовоспалительные и иммуносупрессивные средства (глюкокортикостероидные препараты и др.), или характеризующихся опережением или отставанием полового развития.

Для лабораторных исследований биологическим материалом служила сыворотка периферической крови, забор которой производили в утренние часы вакуумными системами для внутривенного забора крови. В образцах сыворотки при помощи иммуноферментных тест-систем исследовали уровни IL-1β, -4, -6, -10, TNF-α (Вектор-Бест, РФ, Новосибирская обл., п. Кольцово), интерлейкина 17А (eBiosciences, San Diego, CA, USA), остеопротегерина – OPG, лиганда активатора рецептора ядерного фактора κВ – RANKL (Biomedica Medizinprodukte, GmbH & Co KG, A-1210 Wien).

С помощью пакетов прикладных программ «MedStat» и MedCalc® Statistical Software version 20 (MedCalc Software Ltd, Ostend, Belgium; https://www.medcalc.org; 2021) проводили статистический анализ данных. На начальном этапе математической обработки количественных признаков с помощью критерия χ² проводилась оценка вариационных рядов на нормальность распределения данных. Принимая во внимание то, что для большинства исследуемых показателей распределение было отличным от нормального, рассчитывались медиана (Ме), интерквартильный размах (Q1-Q3). Парные сравнения центров независимых выборок проводили с использованием U-теста Манна-Уитни. Сравнение частот признака в двух группах осуществляли при помощи углового преобразования Фишера с учётом поправки Йейтса. Силу связи показателей определяли с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена (rs). Оценку тесноты связи проводили с использованием шкалы Чеддока, считая значения коэффициента меньше 0,3 признаком слабой силы связи, значения более 0,3, но менее 0,5 — признаком умеренной силы связи, значения более 0,5, но менее 0,7 — признаком заметной силы связи, значения более 0,7, но менее 0,9 — признаком высокой силы связи, а значения 0,9 и более — признаком весьма высокой силы связи [21].

Статистически значимыми отличия принимали при р<0,05.

Результаты

Установлено, что сывороточное содержание большинства цитокинов в группе сравнения не отличалось (р>0,05) от аналогичных показателей здоровых лиц и для IL-1β составило 2,15 (1,40–2,85) пг/мл, для IL-4 — 1,95 (1,30–2,65) пг/мл, для IL-10 — 3,10 (2,10–4,25) пг/мл, для IL-17А — 1,90 (1,10–2,80) пг/мл, для TNF-α — 0,00 (0,00-0,30) пг/мл. В то же время лица с НДСТ и НМЦ характеризовались значимым повышением уровней IL-6 (1,60 (0,90–2,40) пг/мл против 1,05 (0,40–1,55) пг/мл в контрольной группе; р=0,002) и RANKL (3,20 (2,25–4,25) пг/мл против 2,50 (1,55–3,20) пг/мл в контрольной группе; р=0,003). Также в группе сравнения нами была зарегистрирована тенденция (р=0,064) к повышению содержания остеопротегерина до значений 81,10 (62,75–100,30) пг/мл против 78,15 (53,35–78,85) пг/мл у здоровых лиц.

Изучение корреляционных связей между уровнями цитокинов позволило установить наличие значимых положительных ассоциаций как в группе здоровых лиц, так и в группе девочек-подростков с НДСТ и НМЦ. В частности, в контрольной группе были зарегистрированы две прямые корреляционные связи слабой силы из 29 возможных. Содержание TNF-α коррелировало с концентрацией OPG (rs=0,247, p=0,041), а уровень IL-6 — с концентрацией IL-17А (rs=0,263, p=0,029). В свою очередь в группе сравнения мы зарегистрировали 11 значимых корреляционных связей слабой и умеренной силы между содержанием различных цитокинов, что было значимо чаще (р=0,010), чем в контрольной группе. Показатели коэффициентов ранговой корреляции Спирмена слабой силы между содержанием цитокинов в группе девочек-подростков с НДСТ представлены в таблице.

Наиболее выраженными (умеренной силы) были корреляции содержания IL-6 с концентрацией RANKL и OPG, а также содержаний RANKL и OPG между собой. Так, значение коэффициента ранговой корреляции Cпирмена при оценке силы связи уровней IL-6 и RANKL (рис. 1) составило 0,324 (р<0,0001).

Аналогичным образом нами была зарегистрирована умеренной силы положительная связь содержания IL-6 с концентрацией OPG (рис. 2). Значение коэффициента ранговой корреляции Cпирмена составило 0,341 (р<0,0001).

В свою очередь концентрация RANKL положительно коррелировала с концентрацией OPG (рис. 3). Значение коэффициента ранговой корреляции Cпирмена составило 0,320 (р<0,0001).

Обсуждение

Выполненные исследования позволили установить взаимосвязи синтеза цитокинов, регулирующих синтез структурных макромолекул соединительной ткани, при НДСТ у девочек-подростков с НМЦ, которые чаще встречались в данной группе обследованных в сравнении со здоровыми лицами аналогичного пола и возраста (p=0,01). У данных лиц на фоне значимого повышения содержания в сыворотке IL-6 и RANKL (p<0,01), а также тенденции (p<0,1) к повышению уровня OPG в 11 случаях были зарегистрированы корреляционные связи между уровнями ряда исследуемых цитокинов (p<0,05 – p<0,0001). При этом наиболее выраженные корреляционные связи (умеренной силы) были зарегистрированы между сывороточным содержанием трёх цитокинов — IL-6, RANKL и OPG. Так, значения сывороточной концентрации IL-6 имели прямые корреляционные связи со значениями сывороточных концентраций RANKL и OPG (p<0,0001). Известно, что RANKL является ключевым фактором дифференцировки и активации остеокластов, а OPG известен как остеокластингибирующий фактор, связывающий RANKL [18][22]. Необходимо отметить, что нами была установлена значимая прямая связь и между уровнями RANKL и OPG (р<0,0001).

Полученные результаты согласуются с современными представлениями о значении иммунной системы, в том числе регуляторов функции фибробластов и остеокластов, в развитии НДСТ. Как известно, кость является специализированной формой соединительной ткани, которая минерализована и в состав которой входит около 28% коллагена I типа и 5% белков неколлагенового матрикса [23]. В свою очередь в основе развития дисплазии соединительной ткани лежат качественные и количественные изменения продукции и сборки коллагена и эластина, синтез незрелого коллагена, дефекты структуры волокон соединительной ткани [24].

Следует отметить, что наличие НДСТ у девочек-подростков с нарушениями месячного цикла сопровождается риском развития остеопенического синдрома [25]. Также в единичных работах указывается на наличие у лиц детского возраста с НДСТ дисбаланса в цитокиновой системе RANK/RANKL/OPG, который сопровождается активацией остеокластогенеза и повышением резорбции костной ткани [26].

Можно предположить, что в ответ на повышение продукции RANKL развивается компенсаторное увеличение продукции OPG, направленное в конечном итоге на нивелирование резорбтивного эффекта указанного лиганда и предотвращение чрезмерной активации остеокластов. Повышенные значения содержания IL-6 могут свидетельствовать о развитии компенсаторной реакции, которая направлена на стимуляцию синтеза коллагена и ускорение созревания фибробластов, что в определенной мере способствует предупреждению развития выраженных диспластических изменений костной ткани [27].

Вместе с тем параллельное с RANKL и OPG увеличение уровня IL-6 может также свидетельствовать о развитии слабовыраженного воспаления, которое обусловлено рядом механизмов. Во-первых, НДСТ сопровождается нарушением перекисного окисления липидов с развитием окислительного стресса, который провоцирует воспалительную реакцию [28]. Во-вторых, при НДСТ повышается риск возникновения воспалительных процессов в различных системах организма как результат нарушения структуры соединительнотканного каркаса [29][30]. В совокупности указанные механизмы обусловливают увеличение синтеза различных как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов.

Заключение

Установлено, что при недифференцированной дисплазии соединительной ткани с нарушением менструального цикла у девочек-подростков повышены сывороточные концентрации IL-6 (р=0,002) и RANKL (р=0,003). Эти изменения сопровождаются увеличением количества корреляционных связей между изученными цитокинами с 2 до 11 из 29 возможных (р=0,010). При этом наиболее выраженные корреляционные связи (умеренной силы) регистрируются между сывороточными уровнями IL-6, RANKL и OPG. Полученные данные отражают механизмы цитокиновой дисрегуляции метаболизма и ремоделирования соединительной ткани и свидетельствуют о развитии слабовыраженного системного воспалительного процесса при НДСТ с НМЦ у девочек-подростков. Результаты исследования могут быть использованы для разработки эффективных индивидуализированных схем лечебно-профилактических мероприятий.