Гендерные различия компонентов инсулиноподобного сигнального пути в тканях почки при локальном и генерализованном светлоклеточном раке почки

Введение

Отличительной чертой рака почки является его непредсказуемость и высокий метаста­тический потенциал [1]. Изучение систем и механизмов пролиферации при раке почки способствует пониманию и прогнозированию опухолевого процесса. Нормальному функционированию почки содействует многокомпонентный комплекс биохимических процессов. В последние годы к уже классическим биохимиче­ским механизмам и представлениям о физиологии по­чек присоединились новые изыскания в молекулярной и генетической областях науки. Благодаря совместному взаимодействию различных областей науки и медицины освещены многие тонкие механизмы как нормального функционирования почек, так и их патологических из­менений. Однако остается еще много потенциальных на­правлений в изучении особенностей деятельности почек при различных патологиях.

Интерес к изучению биомаркеров в онкологии об­условлен целым комплексом свойств, способствующих оценить такие параметры как прогноз заболевания, ме­тастатический потенциал опухоли, эффективность ле­чения и т.д. Особое место среди биомаркеров занимает система инсулиноподобного сигнального пути регуля­ции канцерогенеза. Инсулиноподобные факторы роста 1-го и 2-го типа (IGF-1 и IGF-2) представляют собой высоко гомологичные пептиды друг к другу и инсулину. Примерно 75-85 % от общего количества IGF продуциру­ется клетками печени, а остальная часть тканевой про­дукции приходится на клетки почек, сердца, гипофиза, мозга, желудочно-кишечного тракта, селезенки, надпо­чечников, кожи, мышц и хрящевой ткани [2]. Система реализации эффектов IGF помимо самих IGF-лигандов включает рецепторы и связывающие белки, которые образуют сложно регулируемую сеть взаимодействий как между собой, так и с другими биологическими ре­гуляторами роста и выживаемости клеток [3]. Пере­крестные взаимодействия между биологическими си­стемами вносят существенный вклад в модулирование биологических эффектов для IGF. Так IGF-сигнальный путь, находясь под влиянием гормональной системы, распространяется по организму с кровью, воздействуя на периферические ткани, проявляя так называемый центральный, или эндокринный, механизм действия. Известно, что IGF-1 является главным посредником действия гормона роста (СТГ) и вместе с ИФР пред­ставляют собой гормонально-гуморальную ось, кото­рая вместе с рецепторным аппаратом и связующими белками составляет комплексную морфофункциональ­ную систему, реализующую соматотропную функцию [2]. В периферических тканях именно IGF-1 обеспечи­вает практически все физиологические эффекты СТГ. Регуляция секреции СТГ осуществляется посредством СТГ-рилизинг гормона (СТГ-РГ) и СТГ-ингибирующего фактора (соматостатин) [4][5]. Еще одним примером пе­рекрестных взаимоотношений может послужить путь активации IGF-путь через повышенные концентрации инсулина, и в этом случае инсулин выступает как ми- тоген, хотя в физиологических концентрациях таковым не является [6]. Кроме того, IGF могут синтезировать­ся также клетками различных опухолей и выступать в качестве ауто/паракринных медиаторов, опосредующих рост, метастазирование и антиапоптотические ответы злокачественных клеток [7][8].

Существует ряд опухолей, которые возникают как у мужчин, так и у женщин, но при этом опухолевая болезнь имеет свои особенности сообразно половой принад­лежности. Данный факт, несомненно, вызывает особый интерес среди онкологов, что бесспорно способствует поиску и выявлению гендерных характеристик биохими­ческих и молекулярных маркеров, влияющих на рост и развитие опухоли. Рак почек является той опухолью, ко­торой подвержены как мужчины, так и женщины, но при этом мужчины болеют раком почки в 2 раза чаще жен­щин [1][9]. На полиэтиологичность рака почки указывает целый ряд доказательных факторов риска его развития, в том числе пол, возраст, диабет, избыточная масса тела и т.д. [10][11]. В связи с вышесказанным, считаем акту­альным и необходимым изучение биологической актив­ности и взаимосвязи между различными сигнальными системами при раке почки в зависимости от гендерной принадлежности пациентов.

Цель исследования — изучение показателей инсу­линоподобного сигнального пути, содержания СТГ- рилизинг гормона в тканях почки при локальном и генерализованном светлоклеточном раке почки в зави­симости от гендерной принадлежности больных.

Материал и методы

Дизайн исследования был одобрен этическим коми­тетом ФГБУ «РНИОИ». Обязательным условием включе­ния в исследование было добровольное информирован­ное согласие всех больных, поступивших на комплексное противоопухолевое лечение в отделение онкоурологии РНИОИ. Исследование проведено в соответствии с меж­дународными стандартами GCP. Все больные проходили обследование и лечение в ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России с 2015 по 2017 гг.

Объектом исследования были ткани почки (опухоль, перифокальная зона, условно интактные ткани), полу­ченные при хирургическом лечении 100 больных с ги­стологически подтвержденным светлоклеточным вари­антом рака почки (локальный рак (Т1-2ШМ0) — n=50 и генерализованный (Т3-4ШМ1) — n=50. Стадирование рака почки проводилось в соответствии с классификаци­ей TNM (версия 2017г.). Диагностика рака основывалась на результатах клинического и гистологического заклю­чений в соответствии с отраслевыми стандартами и алго­ритмами объемов диагностики и лечения злокачествен­ных новообразований почки. Гистологический анализ опухоли соответствовал требованиям, предъявляемым к заключению после хирургического лечения. Критерием отбора больных являлся морфологически подтвержден­ный светлоклеточный рак почки. Средний возраст боль­ных составил 57,8±7,9 лет. Тканью перифокальной зоны считали образцы на расстоянии 1 см от видимого края опухоли. Образцы опухоли, ее перифокальной зоны и ус­ловно интактной ткани были взяты во время операции и заморожены для дальнейшего хранения при температуре -70°С с последующим биохимическим исследованием.

В 10 % цитозольных фракциях ткани, приготовлен­ных на калий-фосфатном буфере рН 7.4, содержащим 0,1 % Твин-20 методом ИФА с использованием стандартных тест-систем определяли уровень гормонов и ростовых факторов IGF-1, IGF-2, IGFBP-1, IGFBP-2 (Mediagnost Германия), СТГ-рилизинг (Peninsula Laboratories International США). Определение уровня IGF-1, IGF-2, IGFBP-1, IGFBP-2, СТГ-рилизинга проводили вслепую, не зная какой-либо клинической информации о больных.

Статистический анализ результатов проводили с по­мощью пакета программ Statistica 6,0 (Stat-Soft, 2001). Данные таблиц представлены в виде M±m, где M — ариф­метическое среднее значение, а m — стандартная ошиб­ка среднего. Разницу отличий оценивали по критерию Стьюдента и считали достоверной при р<0,05.

Результаты

В данном исследовании в ходе анализа всего массива полученных данных по содержанию инсулиноподобных факторов роста, связывающих белков и гормонов в тка­нях почки обнаружили статистически значимые разли­чия в зависимости от половой принадлежности больных. Более того, и количество больных среди мужчин и жен­щин существенно разнилось. Так, локальный рак почки был выявлен у 35 мужчин, что составило 70 % больных и у 15 женщин (30% больных). При генерализованном раке почки количество мужчин составило 31 (62 % больных), а женщин — 19 (38 % больных). Представленные данные абсолютно согласуются с мировой и общероссийской статистикой [9], утверждающей, что мужчины больше подвержены данному заболеванию.

Все биохимические результаты были проанализиро­ваны с точки зрения гендерного состава больных и рас­пространенности злокачественного процесса.

В табл. 1 представлены результаты по содержанию инсулиноподобных факторов роста, связывающих бел­ков и СТГ-рилизинга при локальном раке почки у муж­чин и женщин.

В условно интактной ткани почки статистически зна­чимые различия между значениями у мужчин и женщин были выявлены по следующим показателям: IGFВР-2 и СТГ-рилизинг. Уровень белка IGFВР-2 и СТГ-рилизинга у женщин был ниже на 44 % и 40 %, чем у мужчин. В ткани перифокальной зоны отмечались статистически значи­мые различия по тем же показателям, что и в условно ин- тактной ткани почки. При этом уровень IGFВР-2 у жен­щин был выше, чем у мужчин, на 38 % и СТГ-рилизинг ниже в 1,9 раза. В опухолевой ткани локального рака почки присутствовала несколько другая ситуация. По сравнению со значениями у мужчин, в группе женщин отмечалось статистически значимое снижение уровня IGF-1 на 25 %, IGFВР-1 на 29 % и IGFВР-2 в 2 раза соот­ветственно.

В целом, при локальном раке почки не зависи­мо от пола больных основная масса показателей IGF- сигнального пути, кроме СТГ-рилизинга, изменялась однонаправленно, причем самые высокие значения от­мечались в условно интактной ткани, а самые низкие в опухолевой ткани. В случае СТГ-рилизинга присутство­вали противоположные изменения по сравнению с вы­шеперечисленными показателями, и самые высокие зна­чения были зафиксированы в опухолевой ткани, а самые низкие в условно интактной ткани. Несмотря на то, что изменения были однонаправленными, различия по ген­дерному признаку все же имели место быть. Выражалось это в следующем: в условно интактной ткани и ткани перифокальной зоны статистически значимые различия присутствовали в уровне IGFВР-2 и СТГ-рилизинга, а в опухолевой ткани - IGF-1, IGFВР-1 и IGFВР-2. Причем в опухолевой ткани более высокие значения были у муж­чин. Особое внимание к себе привлек IGFВР-2, только уровень данного IGF-связывающего белка статистиче­ски значимо менялся во всех тканях почки (условно интактная ткань, ткань перифокальной зоны и опухолевая ткань), больше ни один из изучаемых показателей не претерпевал статистически значимых изменений во всем тканевом профиле.

Гендерные различия в уровне изучаемых показателей IGF-сигнального пути присутствуют и в случае генерали­зованного светлоклеточного рака почки (табл. 2).

При генерализованном процессе в условно интактной ткани почки обнаружили, что у женщин, по сравне­нию с мужчинами уровень IGFBP-1 был ниже в 2 раза, а IGFBP-2 — в 2,7 раза. В ткани перифокальной зоны почки у женщин, по сравнению с мужчинами, были выявлены повышенные значения следующих показателей: IGFBP-2 на 43,8 % и СТГ-рилизинга на 44,6 %. В опухолевой тка­ни генерализованного рака почки у женщин содержание IGF-1 превосходило соответствующие значения у муж­чин в 1,7 раза, при этом содержание IGF-2 у женщин было статистически значимо ниже на 31 %; также у женщин уровень связывающего белка IGFBP-2 в 2,8 раза и СТГ- рилизинга на 36 % были ниже, чем у мужчин.

Согласно полученным результатам, при генерализо­ванном процессе направленность изменений в системе IGF в целом была такой же, как и при локализованном раке почки: в опухолевой ткани уровень всех изучен­ных показателей, за исключением СТГ-рилизинга, был существенно ниже, чем в перифокальной области и не­измененной ткани. Гендерные различия в опухолевой ткани коснулись значений IGF-1, IGF-2, IGFBP-2, СТГ- рилизинга, а в условно интактной ткани и перифокальной зоне — IGFBP-1, IGFBP-2, СТГ-рилизинга. Также как и в случае локального рака, при генерализованном процессе особое место среди всех показателей занимает IGFBP-2. Только IGFBP-2 статистически значимо изме­нялся во всем тканевом профиле почки при генерализо­ванном процессе.

Подводя итог, можно сказать, что во всех исследуе­мых тканях почки как при локальном, так и при генера­лизованном процессах светлоклеточного рака наиболее информативным показателем, характеризующим гендер­ные различия в реакции на опухолевый процесс явился IGFBP-2.

Обсуждение

Известно, что шесть IGF-связывающих белков с пере­менными функциями и механизмами действий (IGFBP) регулируют активность клеток различными способа­ми. Путем секвестрации IGF от рецептора IGF типа I они могут ингибировать митогенез, дифференцировку, вы­живание и другие IGF-стимулированные события. Протеолиз IGFBP может отменить это ингибирование или сгенерировать фрагменты IGFBP с новой биологической активностью [12]. IGFBPs играют три основные роли: транспортировка IGFs, защита от деградации, и регуля­ция взаимодействия IGFs с IGF-1R. Вместе с тем, IGFBPs могут и сами, независимо от их IGF-связывающих функ­ций, участвовать в биологических процессах.

Физиологическое значение IGFBP-2 в канцерогенезе в настоящее время активно изучается. Было показано, что IGFII / IGFBP2 комплекс может частично связываться с внеклеточным матриксом, где IGF-II может быть высво­божден посредством протеолиза, что указывает на роль IGFBP2 в качестве депо для хранения IGF-II в микроокру­жении опухоли [13]. Кроме того, известно, что IGFBP-2 благодаря наличию в своей структуре интегрин-связывающего мотива стимулирует клеточную подвижность, способствуя тем самым опухолегенезу, инвазии раковых клеток и метастазированию [14]. Так, имеется сообще­ние, что секретируемый IGFBP2 взаимодействует с интегрином ανβ3, активирует (PI3K) / AKT сигнальный путь, приводит к активации проангиогенного фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) -A и в конечном итоге вызывает ангиогенез в меланоме [13]. В нашем исследо­вании изменения количества IGFBP-2 в почке зависит от типа ткани - условно интактной или опухолевой, что, по всей видимости, влечет за собой «переключение» его биологических свойств от депонирования до стимуля­ции опухолевой инвазии. Хотелось бы отметить, что при генерализации процесса как у мужчин, так и у женщин уровень IGFBP-2 существенно превышает таковой при локализованном раке почки почти в 3 раза, что еще раз подтверждает данные литературы об участии данного белка в опухолевой прогрессии. Выявленные гендерные различия в содержании IGFBP-2 могут быть обусловлены тем, что в регуляции транскрипции генов IGF и IGFBPs участвует ряд гормонов, в том числе половые гормоны и инсулин. По данным Тюзикова И.А. и соавторов, 2012, андрогенный дефицит и инсулинорезистентность могут способствовать канцерогенезу в почке у мужчин [10].

Известно, что основным местом синтеза IGF и IGFBP в организме человека является печень, но их могут про­дуцировать и другие органы, в том числе и почки [15]. Имеются данные, свидетельствующие в пользу того, что IGF-1 участвует в регуляции развития почек и их нор­мальном функционировании. Было показано, что IGF-1 необходим для поддержания целостности почечных клу­бочков, в частности для защиты от разрушения подоцитов и базальной мембраны клубочков. Введение IGF-1 крысам приводит к увеличению почечного кровотока и скорости клубочковой фильтрации, что свидетельствует об его участии в регуляции функции почек [16]. Возмож­но, данный факт объясняет обнаруженное нами высокое содержание IGF и IGFBP в интактных тканях почки и перифокальной зоне, а снижение уровня данных факторов в опухоли может свидетельствовать о том, что повреж­денная ткань почки не способна нормально продуциро­вать IGF и IGFBP.

С другой стороны, возможен другой вариант со­бытий. В ряде работ продемонстрировано, что высокие концентрации IGF и IGFBP-3 в плазме крови связаны с повышенным риском развития рака молочной железы, предстательной железы, легкого, поджелудочной железы [17]. В исследованиях на трансгенных мышах с гиперэк­спрессией человеческого IGF -1 в молочной железе было показано, что у 53 % животных развивалась аденокарци­нома молочной железы, что, в свою очередь, позволило авторам сделать вывод о том, что повышение уровня IGF -1 локально в ткани молочной железы в значитель­ной степени способствует развитию РМЖ [18]. Воз­можно, выявленная активация компонентов системы IGF-сигнального пути в интактной ткани почки может способствовать злокачественной трансформации органа. В тоже время, низкий уровень IGF и IGFBP в опухолях почки может быть обусловлен такими факторами как: снижение продукции данных белков, повышение их протеолиза, а также увеличение фракции IGF, депонирован­ных IGFBP.

Пути реализации эффектов IGF сложны и многогран­ны. Семейство IGF образует сложно регулируемую сеть взаимодействий как между собой, так и с другими био­логическими регуляторами роста и выживаемости кле­ток [3]. На примере почки пораженной злокачественным процессом нам хотелось оценить пути перекрестных вза­имодействий между системой факторов роста IGF и гор­мональными регуляторами. Как известно, деятельность почек регулируется с помощью нервных и гуморальных механизмов. IGF-1 является важнейшим эндокринным посредником действия соматотропного гормона (СТГ). IGF-1 также обеспечивает обратную связь с гипоталаму­сом и гипофизом по соматотропной оси. От уровня IGF-1 в крови зависит секреция соматотропин-рилизинг-гормона (СТГ-рилизинг) и соматотропного гормона. При низком уровне IGF-1 в крови секреция СТГ-рилизинга и соматотропина возрастает, при высоком — снижается [5][2]. Возвращаясь к нашему исследованию, мы обнару­жили, что в условно интактной ткани почки присутству­ет такая же закономерность, как и в крови у здоровых людей, а именно: очень высокие значения IGF-1, IGF-2 и низкие уровни СТГ-рилизинга. В опухолевой ткани си­туация диаметрально противоположна - очень низкое содержание IGF-1 и IGF-2 и, напротив, высокий уровень СТГ-рилизинга (табл. 1, 2). Выявленная закономерность характерна как для локального рака почки, так и для ге­нерализованного не зависимо от гендерного фактора.

Выводы

Таким образом, выявлены существенные различия в функционировании системы IGF-сигнального пути в услов­но интактной и опухолевой тканях, а также определены гендерные различия в содержании ее компонентов, что может явиться дополнительным диагностическим и прогностиче­ским критерием при светлоклеточном раке почки.