Preview

Медицинский вестник Юга России

Расширенный поиск

Влияние нейрогенной хронической боли на показатели калликреин-кининовой системы в коже самок мышей в динамике развития меланомы В16/F10

https://doi.org/10.21886/2219-8075-2018-9-2-51-60

Полный текст:

Аннотация

Цель: изучение уровня показателей калликреин-кининовой системы (ККС) в меланоме кожи и коже, не связанной с опухолью, мышей-самок, в динамике роста меланомы В16/F10, воспроизведенной на фоне хронической нейрогенной боли. Материалы и методы: работа выполнена на самках мышей линии С57ВL/6 (n=132) 8-недельного возраста массой 24-26 г. Группы животных: 64 – меланома В16/F10 на фоне хронической нейрогенной боли (основная), 22 – модель хронической нейрогенной боли без перевивки опухоли, 27 – стандартная перевивка меланомы В16/F10 (группа сравнения), 19 самок интактных мышей. Показатели ККС определяли методами ИФА. Статистика: программа Statistica 10 и критерий Вилкоксона. Результаты: влияние хронической боли на развитие перевивной меланомы В16/F10: опухоли в коже мышей основной группы проявлялось через 1 неделю после перевивки, имели двухфокусный рост, 100% метастазирование, помимо печени и легких, в нетрадиционные органы – в сердце и матку. У мышей группы сравнения опухоли появлялись через 2 недели, метастазы – через 4 недели. Средняя продолжительность жизни: в основной группе 19,17±1,35 дней, в группе сравнения – 30,25±1,67 дня. В коже мышей основной группы наблюдали прогрессивный расход кининогена, истощение KLK-1, начиная со второй недели роста опухоли, накопление его в опухоли с максимумом в конце 3 недели. KLK-14 достоверно возрастал в коже, а в опухоли, увеличившись на 1 неделе, стабилизировался. Получены достоверные различия показателей ККС в коже и опухоли мышей сравниваемых групп. Выводы: хроническая нейрогенная боль вызывает радикальную перестройку метаболизма ККС в коже интактных мышей: увеличение содержания кининогена, прекалликреина и снижение количества KLK-1. Перевивка меланомы B16F10 на фоне хронической нейрогенной боли сохраняет рост прекалликреина в коже, но увеличивает его расход в ткани опухоли, одновременно с активацией KLK-1 (в коже вплоть до истощения) и KLK-14.

Для цитирования:


Кит О.И., Котиева И.М., Франциянц Е.М., Каплиева И.В., Козлова Л.С., Бандовкина В.А., Погорелова Ю.А., Черярина Н.Д., Бликян М.В. Влияние нейрогенной хронической боли на показатели калликреин-кининовой системы в коже самок мышей в динамике развития меланомы В16/F10. Медицинский вестник Юга России. 2018;9(2):51-60. https://doi.org/10.21886/2219-8075-2018-9-2-51-60

For citation:


Kit O.I., Kotieva I.M., Frantsiyants E.M., Kaplieva I.V., Kozlova L.S., Bandovkina V.A., Pogorelova Yu.A., Cheryarina N.D., Blikyan M.V. Infl uence of neurogenic chronic pain on indicators of kallikreinkinin system in skin of female mice in dynamics of В16/F10 melanoma development. Medical Herald of the South of Russia. 2018;9(2):51-60. (In Russ.) https://doi.org/10.21886/2219-8075-2018-9-2-51-60

Введение

Боль - сложный процесс, который включает вза­имодействие массива биохимических передат­чиков и рецепторов как в периферической, так и в центральной нервных системах. Хроническая боль связана с изменениями центральной нервной системы (ЦНС), такими как центральная гипервозбудимость, из­менения в матрице боли в головном мозге и нисходящий контроль ноцицепции [1][2][3][4]. Ноцицепция активируется путем стимуляции свободных нервных окончаний воло­кон III группы (Αδ) и IV афферентного (C). Ноцицептивные сигналы генерируются периферическими сенсорны­ми органами, называемыми ноцирецепторами, которые представляют собой окончания нервных волокон малого диаметра, реагирующих на тканевую среду. Бесчислен­ные химические медиаторы, способные активировать, сенсибилизировать или возбуждать ноцицепторы, вклю­чают в себя кинины, провоспалительные и противовос­палительные цитокины, простаноиды, липооксигеназы, «центральный иммунный ответный медиатор» NF-каппа Б, нейротрофины и другие факторы роста, нейропепти­ды, оксид азота, гистамин, серотонин, протеиназы, воз­буждающие аминокислоты, адренергические амины и опиоиды [1][2][3][4]. Эти медиаторы могут действовать в ком­бинации или в возникшем в данный момент процессе, вызывая изменения на молекулярном и рецепторном уровне, которые приводят к гипералгезии или аллодинии. Алгогены и воспалительные медиаторы, высво­бождаемые из тканевой матрицы с помощью эффектов брадикинина, как и сам брадикинин, могут активировать первичные ноцицепторные клетки как через каналы, свя­занные с лиганд-рецептором, так и через рецептор-опосредованное G-белком открытие переходного рецептора потенциальных канонических каналов [5][6].

Для больного раком постоянная и прорывная боль является основной проблемой. Хотя этиология боли в раке остается предметом дискуссий, животные модели боли от рака позволили исследователям прояснить неко­торые вызванные раком невропатологические процессы [7]. В результате происходящих изменений формируется повышенная чувствительность ноцицепторов в месте повреждения - периферическая сенситизация [6][8][9]. В приведенных трудах показано, что изменения соматиче­ских сенсорных путей, вызванных периферическим вос­палением или травмой, приводят к гиперчувствительно­сти и патологической боли, таким как гипералгезия.

Меланома - агрессивная метастатическая опухоль с весьма слабым ответом на стандартные терапевтические подходы, такие как радио- и химиотерапия. Следователь­но, пациенты, диагностированные на поздних стадиях заболевания, часто имеют плохой прогноз. Метастазы меланомы прямо связаны с метастатическим феноти­пом первичной опухоли и являются основной причиной летального исхода онкологических больных. Чтобы до­стичь вторичных органов, опухолевые клетки должны приобретать способность отрываться от первичного участка, вторгаться в строму хозяина и достигать лим­фатических или кровеносных сосудов, чему прямо спо­собствуют отек и воспаление с непременным участием калликреин-кининовой системы (ККС) [3][4][10].

ККС известна как основной регулятор единой по­лисистемы, функции которой направлены на срочную адаптацию организма к изменяющимся условиям вну­тренней и внешней сред [3][4][10]. Семейство тканевых калликреинов (KLKs), охватывающее самый крупный, эволюционно неизменный, кластер сериновых протеиназ человека, который не утрачивает генов, давно привлека­ет внимание исследователей. Уникальные свойства чле­нов семейства KLKs делают их идеальными для многих исследований [11]. KLK вовлечены в разные стадии раз­вития рака и его прогрессии и, как показали испытания специфического антигена простаты - PSA, проявили себя как мощные опухолевые маркеры [11][12]. В клетках рака простаты экспрессия калликреинов-3 и -4 (KLK-3 и KLK- 4) приводит к потере Е-кадгерина и индукции мезенхим­ной экспрессии маркера Виментина, как отличительного признака эпителиально-мезенхимальных переходов, что является важным шагом в изучении метастазирования [12]. Существуют убедительные доказательства того, что члены семейства KLKs дублируют активность друг дру­га попарно и согласованно регулируются в нормальных биологических жидкостях и тканях, в то же время они же часто демонстрируют общие закономерности аномаль­ной экспрессии в патологии [10][11][13]. Потенциал KLKs как биомаркеров рака стал известен после демонстрации ассоциации между уровнями KLK3 или PSA (простат- специфического антигена) и прогрессией рака предста­тельной железы [11][12]. Кроме того, постоянно расту­щее число исследований in vitro и in vivo демонстрирует функциональное участие KLK в процессах, связанных с раком [10][11][12][13][14][15][16][17].

В коже кинины участвуют в клеточной пролиферации в качестве комитогенов, а также участвуют в процессах, распространяющих воспаление и боль [11]. Сенсорные изменения, связанные с различными моделями нейропа­тической боли, всегда связаны с кининовой системой. Ра­нее Ferreira J. et al. [18] получили данные, доказывающие, что именно рецептор B1 играет решающую роль в кон­троле стойкой гипералгезии у мышей в результате воспа­ления, тогда как В2-рецептор играет лишь вспомогатель­ную роль в нарастании отеков. Это подтверждено Luiz et al. в более поздних исследованиях [5]. Werner M.F. et al. [19] показана высокая экспрессия рецепторов кининов B1 и B2 в кожных пробах задних лап мышей и образцах спинного нерва L4-L6 на 12-й день после операции одно­сторонней травмы спинного нерва. Рецептор кинина B1 участвует во множестве патофизиологических событий, связанных с раком, таких как воспаление и ангиогенез. Кроме того, опухоли, образованные из клеток, стимули­рованных В1-специфическим агонистом, проявили не­сколько особенностей снижения агрессивности, таких как меньший размер и инфильтрация воспалительных клеток в области опухоли, более высокие уровни провоспалительных цитокинов, вовлеченных в иммунный ответ против опухолей хозяина [20].

Передача сигналов брадикинином является наиболее мощным индуктором воспалительной боли, это доказа­но, например, при патологии вульвы в клинике, меланоме кожи в эксперименте [3][4][5]. В клинических исследованиях авторами установлено, что рецепторы брадикинина экс­прессируются на повышенных уровнях у онкологических больных, по сравнению со здоровыми, и контролируют­ся фибробластами, которые вырабатывают повышенные уровни провоспалительных медиаторов со стимуляцией брадикинином. Ингибирование экспрессии В1 или обоих брадикининовых рецепторов (В1 и В2) значительно сни­жало продукцию провоспалительных медиаторов. До­казано, что брадикинин активирует сигнализацию ядер­ного фактора основного воспалительного пути, тогда как ингибирование этого пути успешно устраняло медиаторный ответ. Ноцицептивные ответы на периферии, в ко­нечном счете, активируют и сенсибилизируют сигналь­ные болевые нейроны рогов спинного мозга, приводя к спонтанным ноцицептивным реакциям и гиперчувстви­тельности. В эксперименте на модели сингенной мелано­мы кожи B16F10 A.G. Maria et al. [4] сравнивали скорость развития меланомы и генерализации процесса у мышей с нормальным содержанием рецептора брадикинина В1 и его дефицитом, причем у последних обнаружено по­явление опухоли с более высоким уровнем изъязвления, снижением иммунного ответа, более высоким митоти­ческим индексом и более крупными метастатическими колониями.

Цель исследования: изучение уровня некоторых по­казателей ККС в ткани меланомы кожи и участков кожи, не связанных с опухолью, мышей-самок, в динамике ро­ста экспериментальной меланомы В16Ж10, воспроизве­денной на фоне хронической нейрогенной боли.

Материалы и методы

Работа выполнена на самках мышей линии С57ВР/6 (n=132) 8-недельного возраста с начальной массой 24-26 г. Животные получены из ФГБУН «Научный центр био­медицинских технологий «Андреевка» ФМБА (Москов­ская область)». В работе использовали клеточную линию мышиной, метастазирующей в легкие, меланомы В16/ F10, полученную из РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (г. Москва). Животные содержались при естественном ре­жиме освещения со свободным доступом к воде и пище. Все исследования проводились в соответствии с требо­ваниями и условиями, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» и приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.03 «Об утверждении пра­вил лабораторной практики».

Распределение животных: основная группа — 64 жи­вотных, которым меланому В16/F10 воспроизводили по­сле создания модели хронической боли, и контрольная группа — 22 животного с воспроизведенной моделью хронической нейрогенной боли без перевивки опухоли. В группу сравнения (стандартная модель меланомы) вош­ли 27 животных с перевивкой меланомы В16/F10 в той же дозе и объёме, что и в основной группе, но без воспроиз­ведения модели хронической боли. Результаты сравнива­ли с данными, полученными при исследовании кожи 19 самок интактных мышей.

Все манипуляции с животными производили в боксе. Инструменты, посуду, руки дезинфицировали общепри­нятым способом. Каждому животному вводили ксилазолетиловый наркоз: за 10 минут до основного наркоза с целью премедикации животному внутримышечно вво­дили ксилазин (препарат Ксила) в дозе 0,05 мл/кг массы тела (по инструкции), затем Золетил-50 в дозе 10 мг/100 г массы тела. После наступления медикаментозного сна ассистент фиксировал мышь в положении на животе, удалял шерсть сзади в районе проекции седалищных не­рвов и смазывал кожу 70% спиртом. Экспериментатор в стерильных условиях выделял седалищный нерв, накла­дывал на него лигатуру, ушивал рану послойно и обраба­тывал шов 5% спиртовым раствором йода. Через 2 недели после заживления операционной раны подкожно вводи­ли 0,5 мл взвеси опухолевых клеток мышиной меланомы В16/F10 в физиологическом растворе в разведении 1:10. Для этого, соблюдая все условия асептики, описанные выше, ассистент фиксировал мышь спиной кверху, пред­варительно сбрив шерсть и обработав кожу 5% спир­товым раствором йода чуть ниже правой лопатки. Экс­периментатор рукой в стерильной перчатке захватывал кожную складку, в центре которой прокалывал кожу и вводил опухолевую взвесь. Затем извлекал иглу, место введения плотно прижимал ватным тампоном, смочен­ным в 70 % спирте с небольшим добавлением йода, на 1 минуту, чтобы исключить вытекание вводимой взвеси. При стандартной перевивке опухоль появляется в 100 % случаев, достаточно быстро растёт и на 12-16 сутки роста метастазирует, преимущественно гематогенно, в легкие (60-90 %), реже — в печень и селезенку [21].

Через 1, 2 и 3 недели эксперимента животных из групп сравнения и основной быстро декапитировали, все про­цедуры проводили в соответствии с международными правилами работы с животными (European Communities Council Dirertive, 86/609/EEC). Опухоль и кожу выделя­ли сразу после декапитации. Из тканей получали 10% цитозольные фракции, приготовленные на 0,1М калий- фосфатном буфере рН 7.4, содержащем 0,1 % Твин-20 и 1 % БСА, в которых с помощью стандартных тест-систем методами иммуно-ферментного анализа определяли уро­вень кининогена, прекалликреина, KLK-1 и KLK-14.

Статистическая обработка материала проводилась с помощью программы Statistica 10 c определением сред­них значений с указанием стандартных отклонений. Значимость различий средних показателей оценивалась с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона. Суще­ственными считали различия при p<0,05. Анализ корре­ляции между параметрами определяли по коэффициенту линейной корреляции Пирсона «r», корреляцию считали достоверной при р<0,05. При этом соблюдались общие рекомендации для медицинских исследований.

Результаты

Установлено, что нейрогенная хроническая боль при­водит к значимым изменениям некоторых показателей ККС в коже интактных мышей-самок. Так, уровень ки- ниногена был выше значений, полученных при исследо­вании кожи интактных животных (контроль), в 3,0 раза, прекалликреина - в 2,1 раза. При этом содержание KLK-1 было снижено в 2 раза, а KLK-14 - не имело достовер­ных отличий, от контрольных показателей (табл. 1: кожа, боль).

К окончанию 1 недели после перевивки опухоли на фоне хронической нейрогенной боли в коже мышей ос­новной группы с хронической болью резко возрастал уровень KLK-1 — в 2,7 раза, относительно контрольно­го показателя у интактных животных. Уровень KLK-14 увеличивался только в 1,3 раза (р<0,05). Это происходи­ло на фоне снижения содержания кининогена в 1,7 раза (р<0,05), относительно контрольного показателя у жи­вотных с нейрогенной болью. В этот же срок исследова­ния изменения уровня прекалликреина не обнаружено.

В коже мышей группы сравнения через 1 неделю по­сле перевивки меланомы найдены иные изменения. Уро­вень калликреинов, в отличие от показателей у животных основной группы, снижался относительно соответствую­щего контроля: KLK-1 — в 2,7 раза, а KLK-14 — в 1,4 раза (р<0,05). Содержание кининогена в коже животных груп­пы сравнения в этот срок исследования, также, в отличие от показателей у животных основной группы, увеличива­лось в 1,5 раза (р<0,05). Сходным с показателями основ­ной группы мышей было только неизменное, относитель­но контроля, содержание прекалликреина (табл. 1).

 

Таблица/ Table 1.

Уровень показателей ККС в ткани кожи самок мышей с меланомой В16/ F10 и меланомой, сочетанной с хронической болью

Levels of KKS parameters in skin tissues in female mice with B16/F10 melanoma alone and with chronic pain

 

Кининоген

Kininogen

Прекалликреин

Prekallikrein

KLK-1

KLK-14

Интактные животные/ Intact animals

Кожа инт. (контроль)

Intact skin (control)

0,4±0,03

5,6±0,4

380,1±27,9

15,6±1,2

Кожа, боль (контроль)

Int.skin+pain (control)

1,2±0,09 1

11,6±0,8 1

189,5±13,6 1

14,8±1,1

Через 1 неделю после перевивки меланомы В16/F10 1 week after В16/F10 melanoma transplantation

Группа сравнения

Comparison group

0,6±0,05 1

6,4±0,5 1

138,8±10,2 1

10,9±0,9 1

Основная группа

Main group

0,7±0,06 1

12,8±1,1 1

505,0±36,3 1

18,1±1,1 1

2 недели роста меланомы В16/F10 Week 2 of В16/F10 melanoma growth

Группа сравнения

Comparison group

0,55±0,04 1,2

3,7±0,2 1,2

152,0±12,6 1

9,3±0,8 1

Основная группа

Main group

0,4±0,03 1

11,9±1,1 1

132,3±11,7 1,2

20,7±1,1 1,2(р<0,05)

3 недели роста меланомы В16/F10 Week 3 of В16/F10 melanoma growth

Группа сравнения

Comparison group

0,6±0,05 1

13,3±1,2 1,2

304,1±25,8 2

10,3±0,9 1

Основная группа

Main group

0,4±0,03

16,7±1,3 1

83,7±5,6 1,2

32,6±2,2 1,2

Примечание: 1 — различия достоверны, относительно соответствующих данных интактных животных (р<0,05); 2 — различия до­стоверны, относительно предыдущего срока исследования (р<0,05).

Note: 1 — differences were significant, compared with the corresponding values in intact animals (p<0.05); 2 — differences were significant, compared with values in the previous week (p<0.05, if the table does not specify otherwise).

 

Через 2 и 3 недели после перевивки только в коже мышей группы сравнения уровень кининогена оставал­ся без изменений, относительно предыдущего срока ис­следования (табл. 1). В коже мышей основной группы количество кининогена через 2 недели было ниже, чем в предыдущий срок исследования в 1,8 раза и оставалось на этом же уровне после 3 недель роста опухоли.

Прекалликреин через 2 недели после перевивки ме­ланомы В16/Б10 мышам основной группы оставался на прежнем уровне, а через 3 недели возрастал в 1,4 раза, относительно всех предыдущих сроков и контроля интактных животных с нейрогенной болью (табл. 1). В коже мышей группы сравнения прекалликреин снижался че­рез 2 недели в 1,7 раза и возрастал к концу 3-й недели в 3,6 раза, относительно предыдущего срока исследования.

KLK-1 в коже мышей основной группы последова­тельно снижался: в 3,8 раза к концу 2 недели и в 1,6 раза к концу 3 недели относительно предыдущих сроков из­мерения. В конечном итоге его количество было снижено в 4,5 раза относительно интактной кожи и в 2,3 раза от­носительно данных кожи контрольных животных с ней­рогенной болью. В коже мышей группы сравнения через 2 недели роста меланомы В16/Б10 количество KLK-1 не изменилось по сравнению с 1-й неделей, а через 3 недели увеличилось в 2,0 раза относительно данных 2 недели.

KLK-14 в коже мышей основной группы через 2 не­дели роста меланомы В16/Б10 сохранил тенденцию к уве­личению (на 14,4 %, р=0,05), а через 3 недели его количе­ство возросло в 1,6 раза относительно данных 2 недели и было выше соответствующего контроля в 2,2 раза. В коже мышей группы сравнения через 2 недели уровень KLK-14 снизился в 1,2 раза, а после 3 недель роста опухо­ли вновь соответствовал данным 1 недели, что было в 1,5 раза ниже соответствующего контроля.

В ткани опухоли меланомы В16/Б10 мышей основной группы через 1 неделю после перевивки меланомы В16/F10 найдено падение уровня кининогена в 2,0 раза и пре­калликреина — в 3,3 раза относительно соответствующего контроля (интактных животных с нейрогенной болью). При этом возросли KLK-1 — в 1,9 раза (р<0,05) и KLK-14 — в 3,1 раза (табл. 2). Как упоминалось, в группе сравнения в этот срок исследования опухоли не выявлены.

Через 2 недели эксперимента в ткани опухоли мела­номы В16Ж10 у мышей основной группы состояние всех изученных компонентов ККС достоверно не изменялось, относительно показателей в предыдущий срок исследо­вания. В этот срок в ткани опухоли животных группы сравнения найдено увеличение содержания кининогена в 2,0 раза относительно соответствующего контроля и KLK-14 - в 8,6 раза (табл. 2).

 

Таблица/ Table 2.

Уровень показателей ККС в ткани опухоли самок мышей с меланомой В16/ F10 и меланомой, сочетанной с хронической болью

Levels of KKS parameters in tumor tissues in female mice with B16/F10 melanoma alone and with chronic pain

Группы

Groups

Кининоген

Kininogen

Прекалликреин

Prekallikrein

KLK-1

KLK-14

Интактные животные/ Intact animals

Кожа (контроль) Intact skin (control)

0,4±0,03

5,6±0,41

380,1±27,9

15,6±1,21

Кожа, боль (контроль) Int.skin+pain (control)

1,2±0,09 1

11,6±0,81 1

189,5±13,6 1

14,8±1,12

Через 1 неделю после перевивки меланомы В16/F10 1 week after В16/F10 melanoma transplantation

Группа сравнения Comparison group

Образования опухолевых узлов не регистрировали No tumors were registered

Основная группа Main group

0,6±0,046 1

3,5±0,30 1

363,6±27,8

58,2±4,7 1

2 недели роста меланомы В16/F10 Week 2 of В16/F10 melanoma growth

Группа сравнения Comparison group

0,8±0,061 1

5,8±0,42

357,0±26,6

134,2±11,4 1,2

Основная группа Main group

0,6±0,041 1

4,5±0,33 1,2

376,8±29,4

41,4±3,4 1,2

3 недели роста меланомы В16/F10 Week 3 of В16/F10 melanoma growth

Группа сравнения Comparison group

3,2±0,22 1

4,2±0,31 1

383,4±29,1

71,3±5,8 1,2

Основная группа

0,6±0,043 1

4,8±0,36 1(р<0,05)

489,2±35,7 1,2

42,1±3,5 1

Примечание: 1 — различия достоверны, относительно соответствующих данных интактных животных (р<0,05); 2 — различия до­стоверны, относительно предыдущего срока исследования (р<0,05).

Note: 1 — differences were significant, compared with the corresponding values in intact animals (p<0.05, if the table does not specify otherwise); 2 — differences were significant, compared with values in the previous week (p<0.05).

 

Через 3 недели роста опухоли в ткани меланомы жи­вотных основной группы вновь не обнаружено измене­ний исследованных показателей ККС, относительно пре­дыдущих сроков исследования.

В то же время, в ткани меланомы В16Ж10 у мышей группы сравнения найдены достоверные изменения не­которых показателей ККС. Так, уровень кининогена че­рез 3 недели после перевивки в опухоли возрос в 4,0 раза относительно предыдущего срока исследования и в 8,0 раз относительно показателя у интактных контрольных животных (табл. 2). В это же время содержание прекал­ликреина снизилось в 1,4 раза (р<0,05). Уровень KLK-14, хоть и снизился в 1,9 раза (р<0,01), относительно пре­дыдущего срока, однако оставался в 4,6 раза выше кон­трольных величин интактных животных.

Наблюдения, сделанные в ходе эксперимента, пока­зали, что влияние хронической боли на развитие пере­вивной меланомы В16Ж10 характеризовалось несколь­кими признаками. Опухоли в коже животных основной группы появлялись раньше, уже через 1 неделю после перевивки, имели двухфокусный рост, метастазирование — 100%, помимо традиционных мишеней (печени и легких), в нетрадиционные органы, а именно в сердце и матку. У мышей группы сравнения опухоли появлялись через 2 недели, метастазы регистрировались только через 4 недели. Сокращались сроки жизни животных: средняя продолжительность жизни для мышей основной группы составляла 19,17±1,35 дней, в группе сравнения первая смерть наступила на 24 сутки, а средняя продолжитель­ность их жизни составила 30,25±1,67 дня.

Обсуждение

Понимание механизмов, лежащих в основе хрони­ческих болевых состояний, станет серьезным шагом в развитии новых методов лечения, предназначенных специально для конкретных механизмов хронической боли, влекущей за собой пластические изменения в цен­тральной нервной системе, вызванные повышенной ак­тивностью в ноцицептивных первичных афферентных нервных волокнах. Однако до недавнего времени о ме­таболических изменениях, лежащих в основе этих очень длительных изменений возбудимости первичных афферентов, связанных с хроническими болевыми состояни­ями, известно мало.

Кинины являются мощными эндогенными алго- генными пептидами, и их роль в передаче боли широко обсуждалась [3][4][10][11][22]. После воздействия калликре- инов на кининоген и образования кининов последние ре­ализуют свои действия через активацию двух подтипов GPCR, называемых рецепторами B1 и B2 [23]. Брадики- нин является ведущим алгогеном и ключевым медиато­ром воспалительной гипералгезии. Внутримышечное введение брадикинина может вызвать боль и модифици­ровать восприимчивые поля нейронов дорсального рога к вредным раздражителям [3][4][15]. Таким образом, брадикинин может быть важным фактором возникновения и развития хронической боли.

Известно, что KLK-1 является более широко пред­ставленной кининогеназой, чем остальные члены семей­ства KLKs, и единственным клеточным калликреином с абсолютно специфичной кининогеназной активностью, а также высокоактивным адаптогеном к усиленному протеолизу [11][24]. Его ферментативная деятельность сводится к высвобождению брадикинина из низкомоле­кулярного кининогена, который, в свою очередь, соеди­няется со специфическим G-белком поверхностных кле­точных рецепторов [3]. Хроническая нейрогенная боль, как показывают результаты настоящего исследования, не вызывала увеличения образования брадикинина в коже интактных самок мышей с перевязанными седалищными нервами, так как уровень кининогена регистрировался втрое выше, чем у здоровых мышей (без нейрогенной боли), а KLK-1, напротив, вдвое ниже. Брадикинин яв­ляется острофазовым полипептидом, поэтому неуди­вительно, что хроническая боль в исследованные сроки не сопровождалась увеличением его содержания в коже животных. Вместе с тем, повышенное содержание прекалликреина на фоне сниженного уровня KLK-1 свиде­тельствовало об усилении его синтеза под действием хро­нической боли.

Рак и иммунные клетки в области расположения опу­холевых масс высвобождают несколько нейроиммунных медиаторов, которые взаимодействуют с различными ре­цепторами на периферических ноцицептивных нервных терминалах для развития аномального выделения и ги­первозбудимости. Кроме того, опухоли, растущие вбли­зи периферических нервов, могут поставить под угрозу целостность нерва, вызывая невропатическое состояние, сопровождающееся постоянной болью, гипералгезией или аллодинией. Оба эти действия опухолей на пери­ферический нерв могут привести к центральной сен­сибилизации, что еще больше повысит эффективность ноцицептивной передачи через спинной мозг и воспри­ятие спонтанной и прорывной боли [7]. Брадикинин, как продукт метаболизма ККС, находящийся на первом месте в ряду алгогенов, является одним из важнейших медиаторов воспаления [3][4][10]. Наличие связи между воспалением и раком было предположено еще в начале века [25], а в последнее время воспаление считается при­знаком рака [26], но конкретная роль иммунных клеток в области опухолей до сих пор полностью не выяснена. Ка­саясь медиаторной роли кининов, следует отметить по­лиморфизм их биологического действия и клинических проявлений, возникающих при активации калликреина: они повышают внутрикапиллярное и венозное давление, усиливают экссудацию, стимулируют пролиферацию Т-лимфоцитов, продукцию ими лимфокинов, усилива­ют пролиферацию фибробластов, синтез коллагена, тем самым стимулируя пролиферацию, наконец, взаимодей­ствуют с ноцирецепторами.

Следует подчеркнуть, что свободные кинины непо­средственно вызывают хемотаксис и дегрануляцию лей­коцитов, усиливают синтез простагландинов многими типами клеток, а также высвобождение гистамина из туч­ных клеток [3][4], что также усиливает болевую реакцию. Агонисты рецептора кинина B1 индуцировали дозоза­висимую секрецию нейтрофилами KLK1, KLK6, KLK10, KLK13 и KLK14 в культуральную среду [27]. Авторы из­учали экспрессию и биорегуляцию KLKs в человеческих нейтрофилах и рецептор B1, с точки зрения, индуцирует ли стимуляция с помощью кининового рецептора В1 их секрецию. Методом проточной цитометрии авторами установлено, что нейтрофилы экспрессируют только KLK1, KLK4, KLK10, KLK13, KLK14 и KLK15. При модели­ровании меланомы В16/Б10 увеличение KLK-14 наблюда­ли и в коже, и в ткани опухоли мышей основной группы. В исследовании Paterson C.J. et al. [15] найден надежный и неинвазивный метод оценки алгогенных эффектов брадикинина у людей. Авторы смогли разделить несколько различных эффектов брадикинина, включая эффекты агонистов B1- и В2-рецепторов. Учитывая литературные данные и настоящие результаты, увеличение расхода кининогена и количества KLK1 и KLK14 в процессе роста мышиной меланомы B16F10 на фоне хронической нейро­генной боли свидетельствует об увеличении количества свободных кининов как в опухоли, так и в коже, непо­средственно не связанной с опухолью, с реализацией их биологических свойств. Tiphaine Delaunay et al. [10] уста­новлены коррелятивные связи экспрессии калликреинов со степенью агрессивности меланомы человека, в частно­сти, клеточной миграцией и глубиной инвазии.

Итак, очевидно, что перевивка меланомы B16F10 на фоне хронической нейрогенной боли вызывала в коже мышей основной группы усиленное образование брадикинина, о чем свидетельствует прогрессивный расход ки- ниногена и KLK-1 в динамике роста меланомы, начиная со второй недели после перевивки опухоли. KLKs име­ют различные паттерны экспрессии и физиологическую роль, связанную, в том числе, со злокачественными про­цессами, такими как регуляция роста клеток, ангиогенез, инвазия и метастазирование [10][16].

Показано, что калликреины и сами поддерживают ангиогенез путем прямого или опосредованного разру­шения внеклеточного матрикса [11]. Доказано также, что одновременно возникают перекрестные реакции между известными протеолитическими путями и калликреиновыми каскадами, с акцентом на активацию плазмина и ее последствия, например, при раке простаты [28]. Ehrenfeld P. et al. [29] показано, что агонисты рецептора B1 действу­ют как функциональный стимул для секреции KLK-1, события, предшествующего производству кининов и клеточной инвазии. Авторами исследована возможность экспрессии истинных кининов тканевым KLK-1 из кле­ток рака молочной железы, в дополнение к стимуляции рецептора B1. В этом же исследовании показано, что стимулирование клеток рака молочной железы аналогом брадикинина вызывала высвобождение металлопроте- иназ (ММП-2 и ММП-9) и увеличивала пролиферацию клеток. В настоящем исследовании количество KLK-1 в неповрежденной коже возрастало к концу 1 недели после перевивки меланомы В16/F10 на фоне хронической боли с последующим его истощением и накоплением в опухо­ли с максимумом в конце 3 недели. Правомерно предпо­ложение о том, что KLK-1 принимает непосредственное участие в росте меланомы и образовании ее сосудистой сети. Возможно также предположение о том, что опухоль меланомы может «использовать» эндогенные KLK для своего роста, ангиогенеза и прогрессии.

Это предположение подкрепляется динамикой KLK- 14 (специфичного для кожи): в неповрежденной коже мышей основной группы его количество устойчиво рас­тет, а в опухоли, увеличившись на 1 неделе, стабилизи­руется. Еще C.A. Borgono et al. [13] показано, что KLK14 является прямым участником нескольких направлений прогрессирования опухоли, включая рост, инвазию и ан­гиогенез. В обзоре Pavlopoulou A. еt al. [11] подчеркивает­ся роль калликреинов в развитии различных видов рака: калликреины «вовлечены в разные стадии развития рака и его прогрессии и, как показали испытания PSA (про­статический специфический антиген — KLK-3, прим. автора), проявились как важные опухолевые маркеры». Увеличение активности KLK-14 приводит к усилению протеолиза белковых субстратов кожи и непосредствен­ной активации ММП-9, которая разрушает коллаген IV типа и другие компоненты базальной мембраны [30]. Белковые субстраты, которые образуют поверхностный слой кожи, развиваются совместно с их специфическими ферментами (KLK), поскольку последние играют важную роль в обновлении эпидермиса [11].

В обзоре Kontos C.K. et al. [14] изложен современный взгляд на состояние KLKs, как опухолевых маркеров. Ав­торами подчеркивается, что экспрессия различных KLKs прямо связана с клинико-патологическими параметрами онкологических больных. Несколько KLKs выполняют значительную прогностическую роль, благоприятную или неблагоприятную, при различных злокачественных опухолях, начиная с PSA, который теперь наиболее ши­роко используется, как биомаркер, в клинической прак­тике. Остальные члены семейства KLKs также считаются очень перспективными биомаркерами для индивидуали­зации терапии рака, особенно для мониторинга и про­гнозирования реакции пациента на химиотерапию.

В обзоре Avgeris M., Scorilas A. [17] обобщена роль KLKs в физиологии и патологии человека, особое вни­мание уделялось раку простаты и кожным заболева­ниям. Авторами обсуждались последние достижения в развитии терапии на основе регуляции KLKs. Под­черкивается, что большое количество разнообразных высокоэффективных ингибиторов-регуляторов KLKs, аналогичных эндогенным или с небольшими отличиями, уже синтезировано. Обнадеживающие результаты были задокументированы при использовании вакцин и имму­нотерапии на основе KLKs, а также активации зимогенов лекарственных средств, опосредованной KLK. Критиче­ская роль семейства KLKs во многих патологиях человека подчеркивает важность KLK как привлекательных моле­кулярных мишеней для разработки новых терапевтиче­ских средств и схем лечения.

В обзоре Kryza T. et al. [12] всесторонне рассмотрены биохимические особенности тканевых калликреинов, их функциональная роль в канцерогенезе, а также послед­ние разработки и успешность терапии, «управляющей» калликреинами в противодействии прогрессированию рака. Потенциал семейства KLKs как биомаркеров рака теперь хорошо известен, после демонстрации ассоци­ации между уровнями KLK3 (PSA) и прогрессией рака предстательной железы.

В настоящем исследовании одновременный рост прекалликреина и кининогена в коже при моделировании нейрогенной боли указывает на радикальную перестрой­ку метаболизма ККС всего пораженного органа в процес­се формирования болевого синдрома. Далее, в динамике роста меланомы B16F10 на болевом фоне, в коже количе­ство прекалликреина оставалось высоким с достоверным увеличением к концу наблюдения. В опухоли, начиная с 1 недели, содержание прекалликреина было снижено с достоверным повышением, не достигающим нормы, в по­следующие сроки наблюдения.

Таким образом, представленные данные доказывают угнетающее влияние хронической нейрогенной боли на процессы адаптации и защиты организма, в котором раз­вивается злокачественная опухоль. Полученные резуль­таты, касающиеся содержания в коже и опухоли исследо­ванных компонентов ККС при росте меланомы B16F10 на фоне нейрогенной боли, могут иметь значение для кли­ники при выяснении молекулярного механизма развития меланомы и ее лечения, а также других онкологических заболеваний, при которых активность KLK повышена. Постоянно растущее число исследований in vitro и in vivo демонстрирует непосредственное участие KLK в процес­сах, связанных с раком. Эти соединения теперь счита­ются ключевыми в регуляции роста раковых клеток, их миграции, инвазии, химиорезистентности и, что важно, в посредничестве между раковыми клетками и другими клеточными популяциями микроокружения опухоли для облегчения прогрессирования рака. Функциональная роль KLK в развитии рака подчеркивает их потенциал в разработке новых противораковых подходов.

Результаты проведенного исследования должны счи­таться предварительными, так как необходимо дальней­шее изучение не только специфичных калликреинов, но и кининогенов, и рецепторов брадикинина В1 и В2, а также эндогенных ингибиторов протеолиза и других смежных систем в росте и метастазировании меланомы B16F10 на фоне нейрогенной боли. Понимание роли ККС в генезе этой опухоли может быть полезно для клиницистов, так как должно привести к новым терапевтическим подхо­дам и персонализации лечения.

Выводы

  1. Хроническая нейрогенная боль вызывает ради­кальную перестройку метаболизма ККС в коже интактных мышей, а именно увеличение содержания кининогена, прекалликреина и снижение количе­ства KLK-1.
  2. Перевивка меланомы B16F10 на фоне хронической нейрогенной боли сохраняет рост прекалликреина в коже, но увеличивает его расход в ткани опухоли одновременно с активацией KLK-1 (в коже вплоть до истощения) и KLK-14.

Список литературы

1. Kuner R. Central mechanisms of pathological pain. // Nat Med. – 2010. – V.16(11). – P. 1258-1266. doi: 10.1038/nm.2231

2. Schweinhardt P., Bushnell M.C. Pain imaging in health and disease–how far have we come? // J Clin Invest. – 2010. – V.120(11). – P.3788-97. doi: 10.1172/JCI43498.

3. Falsetta M.L., Foster D.C., Woeller C.F., Pollock S.J., Bonham A.D., Haidaris C.G., Phipps R.P. A Role for Bradykinin Signaling in Chronic Vulvar Pain. // J Pain. – 2016. – V.17(11). – P.1183-1197. doi: 10,1016/j.jpain.2016.07.007

4. Maria A.G., Dillenburg-Pilla P., Reis R.I., Floriano E.M., TeféSilva C., Ramos S.G., Pesquero J.B., Nahmias C., Costa-Neto C.M. Host kinin B1 receptor plays a protective role against melanoma progression. // Sci Rep. – 2016. – V.6. – P.22078. doi: 10.1038/srep22078

5. Luiz A.P., Schroeder S.D., Rae G.A., Calixto J.B., Chichorro J.G. Th e contribution and interaction of kinin receptors and dinorphin A in the model of neuropathic pain of the trigeminal nerve in mice. // Neuroscience. – 2015. – V.300. – P. 189-200. doi: 10.1016/j.neuroscience.2015.05.015

6. Takeda M., Takehana S., Sekiguchi K., Kubota Y., Shimazu Y. Modulatory Mechanism of Nociceptive Neuronal Activity by Dietary Constituent Resveratrol. // Int J Mol Sci. – 2016. – V.17(10). – P.pii: E1702. doi: 10.3390/ijms17101702

7. Schmidt Bryan L., Hamamoto Darry T., Simone D., Wilcox George L. Mechanism of pain in cancer. // Mol Interv. – 2010. – V.10 (3). – P.164-178. doi: 10.1124/mi.10.3.7

8. Yang F., Xu Q., Shu B., Tiwari V., He S.Q., Vera-Portocarrero L.P., et al. Activation of cannabinoid CB1 receptor contributes to suppression of spinal nociceptive transmission and inhibition of mechanical hypersensitivity by Aβ-fi ber stimulation. // Pain. – 2016. – V.157(11). – P. 2582-2593. DOI: 10.1097/j.pain.0000000000000680

9. Basso L., Altier C. Transient Receptor Potential Channels in neuropathic pain. // Curr Opin Pharmacol. – 2017. – V.32. – P.9-15. doi: 10.1016/j.coph.2016.10.002

10. Delaunay T., Deschamps L., Haddada M., Walker F., Soosaipillai A., et al. Aberrant expression of kallikrein-related peptidase 7 is correlated with human melanoma aggressiveness by stimulating cell migration and invasion. // Mol Oncol. – 2017. – V.11(10). – P.1330-1347. doi: 10.1002/1878-0261.12103

11. Pavlopoulou A., Pampalakis G., Michalopoulos I., Sotiropoulou G. Evolutionary History of Tissue Kallikreins. // PLoS One. – 2010. – V.1(5). – P.e13781. doi: 10.1371/journal.pone.0013781

12. Kryza T., Silva M.L., Loessner D., Heuzé-Vourc’h N., Clements J.A. Th e kallikrein-related peptidase family: Dysregulation and functions during cancer progression. // Biochimie. – 2016. – V.122. – P. 283-99. doi: 10.1016/j.biochi.2015.09.002

13. Borgoño C.A., Michael I.P., Komatsu N., Jayakumar A., Kapadia R., et al. A potential role for multiple tissue kallikrein serine proteases in epidermal desquamation. // J Biol Chem. – 2007. – V.282. – P.3640-52.

14. Kontos C.K., Scorilas A. Kallikrein-related peptidases (KLKs): a gene family of novel cancer biomarkers. // Clin Chem Lab Med. – 2012. – V.50(11). – P. 1877-91. Doi: 10.1515/cclm-20120247

15. Paterson C.J., Zambreanu L., Bennett D., McMahon S.B. Characteristics and mechanisms of pain caused by bradykinin, in humans using iontophoresis. // Pain. – 2013. – V.154(6). – P. 782-792. doi: 10.1016 / j.pain.2013.01.003

16. Koumandou V.L., Scorilas A. Evolution of the plasma and tissue kallikreins, and their alternative splicing isoforms. // PLoS One. – 2013. – V.8(7). – P.e68074. doi: 10.1371/journal. pone.0068074

17. Avgeris M., Scorilas A. Kallikrein-related peptidases (KLKs) as emerging therapeutic targets: focus on prostate cancer and skin pathologies. // Expert Opin Th er Targets. – 2016. – V.20(7). – P.801-18. doi: 10.1517/14728222.2016.1147560

18. Ferreira J., Campos M.M., Peshero J.B., Araujo R.K., Bader M., Calixto J. Evidence of the participation of kinins in Freundinduced adjuvant infl ammatory and nociceptive responses in mouse knockout mice of B1 and B2 kin. // Neuropharmacology. – 2001. – V. 41(8). – P. 1006-12.

19. Werner M.F., Kassuya C.A., Ferreira J., Zampronio A.R., Calixto J.B., Rae G.A. Mechanisms controlled by peripheral kinin receptors B (1) and B (2) are involved in neuropathic nociception caused by ligation of the spinal nerve in rats. // Neuropharmacology. – 2007. – V.53(1). – P.48-57. doi: 10.1016/j.neuropharm.2007.04.013

20. Dillenburg-Pilla P., Maria A.G., Reis R.I., Floriano E.M., Pereira C., et al. Kinin B1 receptor activation enhances melanoma tumor growth and metastasis. // PLoS One. – 2013. – V. 8(5). – P.e64453. doi: 10.1371 / journal.pone.0064453

21. Dingemanе K.P. B-16 Melanoma Metastasis in Mouse Liver and Lung. // Inv. Metast. – 1985. – V.(5). – P.50-60.

22. Huang X., Player M.P. B1 Bradykinin receptor antagonists as potential therapeutic agents for pain. // J Med Chem. – 2010. – V.53. – P.5383-5389.

23. Costa R., Motta E.M., Dutra R.C., Magnavaci M.N., Bento A. F., et al. Antinociceptive action of kinase receptor antagonists B 1 and B 2 on peripheral neuropathy induced by paclitaxel in mice. // Br J Pharmacol. – 2011. – V.164 (2b). – P.681-693. doi: 10.1111/j.1476-5381.2011.01408.x

24. Tang S.C., Leung J.C., Lai K.N. Th e kallikrein-kinin system. // Contribution of Nephrole. – 2011. – V.170. – P.145-55. doi: 10.1159/000325650

25. Balkwill F., Mantovani A. Infl ammation and cancer: back to Virchow? // Lancet. – 2001. – V.(17). – P.539-545 doi: 10.1016/S0140-6736(00)04046-0

26. Hanahan D., Weinberg R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. // Cell. – 2011. – V.144. – P.646-674. doi: 10.1016/j.cell.2011.02.013

27. Lizama A.J., Andrade Y., Colivoro P., Sarmiento J., Matus C.E., et al. Expression and bioregulation of the kallikrein-related peptidases family in the human neutrophil. // Innate Immun. – 2015. – V.21(6). – P.575-86. doi: 10.1177/1753425914566083

28. Pampalakis G., Sotiropoulou G. Tissue kallikrein proteolytic cascade pathways in normal physiology and cancer. // Biochim Biophys Acta. – 2007. – V.1776(1). – P.22-31. doi: 10.1016/j.bbcan.2007.06.001

29. Ehrenfeld P., Manso L., Pavicic M.F., Matus C.E., Borquez C., et al. Bioregulation of kallikrein-related peptidases 6, 10 and 11 by the kinin B1 receptor in breast cancer cells. // Anticancer Res. – 2014. – V.34(12). – P. 6925-38.

30. Menashi S., Fridman R., Desrivieres S., Lu H., Legrand Y., Soria C. Regulation of 92-kDa gelatinase B activity in the extracellular matrix by tissue kallikrein. // Ann N Y Acad Sci. – 1994. – V.732(6). – P. 466-8.


Об авторах

О. И. Кит
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт.
Россия

Кит Олег Иванович, член-корр. РАН, д.м.н., профессор, генеральный директор.

Ростов-на-Дону.



И. М. Котиева
Ростовский государственный медицинский университет.

Котиева Инга Мовлиевна, к.м.н., доцент кафедры патологической физиологии.

Ростов-на-Дону.



Е. М. Франциянц
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт.

Франциянц Елена Михайловна, д.б.н., профессор, заместитель генерального директора по науке.

Ростов-на-Дону.



И. В. Каплиева
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт.

Каплиева Ирина Викторовна, к.м.н., старший научный сотрудник.

Ростов-на-Дону.



Л. С. Козлова
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт.

Козлова Лариса Степановна, к.б.н., доцент, старший научный сотрудник.

Ростов-на-Дону.



В. А. Бандовкина
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт.

Бандовкина Валерия Ахтямовна, к.б.н., старший научный сотрудник.

Ростов-на-Дону.



Ю. А. Погорелова
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт.

Погорелова Юлия Александровна, к.б.н., старший научный сотрудник.

Ростов-на-Дону.



Н. Д. Черярина
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт.

Черярина Наталья Дмитриевна, врач лаборант.

Ростов-на-Дону.



М. В. Бликян
Ростовский государственный медицинский университет.

Бликян Марина Владимировна, к.м.н., ассистент кафедры патологической физиологии.

Ростов-на-Дону.



Для цитирования:


Кит О.И., Котиева И.М., Франциянц Е.М., Каплиева И.В., Козлова Л.С., Бандовкина В.А., Погорелова Ю.А., Черярина Н.Д., Бликян М.В. Влияние нейрогенной хронической боли на показатели калликреин-кининовой системы в коже самок мышей в динамике развития меланомы В16/F10. Медицинский вестник Юга России. 2018;9(2):51-60. https://doi.org/10.21886/2219-8075-2018-9-2-51-60

For citation:


Kit O.I., Kotieva I.M., Frantsiyants E.M., Kaplieva I.V., Kozlova L.S., Bandovkina V.A., Pogorelova Yu.A., Cheryarina N.D., Blikyan M.V. Infl uence of neurogenic chronic pain on indicators of kallikreinkinin system in skin of female mice in dynamics of В16/F10 melanoma development. Medical Herald of the South of Russia. 2018;9(2):51-60. (In Russ.) https://doi.org/10.21886/2219-8075-2018-9-2-51-60

Просмотров: 282


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2219-8075 (Print)
ISSN 2618-7876 (Online)