Влияние нейрогенной хронической боли на показатели калликреин-кининовой системы в коже самок мышей в динамике развития меланомы В16/F10

Введение

Боль - сложный процесс, который включает вза­имодействие массива биохимических передат­чиков и рецепторов как в периферической, так и в центральной нервных системах. Хроническая боль связана с изменениями центральной нервной системы (ЦНС), такими как центральная гипервозбудимость, из­менения в матрице боли в головном мозге и нисходящий контроль ноцицепции [1][2][3][4]. Ноцицепция активируется путем стимуляции свободных нервных окончаний воло­кон III группы (Αδ) и IV афферентного (C). Ноцицептивные сигналы генерируются периферическими сенсорны­ми органами, называемыми ноцирецепторами, которые представляют собой окончания нервных волокон малого диаметра, реагирующих на тканевую среду. Бесчислен­ные химические медиаторы, способные активировать, сенсибилизировать или возбуждать ноцицепторы, вклю­чают в себя кинины, провоспалительные и противовос­палительные цитокины, простаноиды, липооксигеназы, «центральный иммунный ответный медиатор» NF-каппа Б, нейротрофины и другие факторы роста, нейропепти­ды, оксид азота, гистамин, серотонин, протеиназы, воз­буждающие аминокислоты, адренергические амины и опиоиды [1][2][3][4]. Эти медиаторы могут действовать в ком­бинации или в возникшем в данный момент процессе, вызывая изменения на молекулярном и рецепторном уровне, которые приводят к гипералгезии или аллодинии. Алгогены и воспалительные медиаторы, высво­бождаемые из тканевой матрицы с помощью эффектов брадикинина, как и сам брадикинин, могут активировать первичные ноцицепторные клетки как через каналы, свя­занные с лиганд-рецептором, так и через рецептор-опосредованное G-белком открытие переходного рецептора потенциальных канонических каналов [5][6].

Для больного раком постоянная и прорывная боль является основной проблемой. Хотя этиология боли в раке остается предметом дискуссий, животные модели боли от рака позволили исследователям прояснить неко­торые вызванные раком невропатологические процессы [7]. В результате происходящих изменений формируется повышенная чувствительность ноцицепторов в месте повреждения - периферическая сенситизация [6][8][9]. В приведенных трудах показано, что изменения соматиче­ских сенсорных путей, вызванных периферическим вос­палением или травмой, приводят к гиперчувствительно­сти и патологической боли, таким как гипералгезия.

Меланома - агрессивная метастатическая опухоль с весьма слабым ответом на стандартные терапевтические подходы, такие как радио- и химиотерапия. Следователь­но, пациенты, диагностированные на поздних стадиях заболевания, часто имеют плохой прогноз. Метастазы меланомы прямо связаны с метастатическим феноти­пом первичной опухоли и являются основной причиной летального исхода онкологических больных. Чтобы до­стичь вторичных органов, опухолевые клетки должны приобретать способность отрываться от первичного участка, вторгаться в строму хозяина и достигать лим­фатических или кровеносных сосудов, чему прямо спо­собствуют отек и воспаление с непременным участием калликреин-кининовой системы (ККС) [3][4][10].

ККС известна как основной регулятор единой по­лисистемы, функции которой направлены на срочную адаптацию организма к изменяющимся условиям вну­тренней и внешней сред [3][4][10]. Семейство тканевых калликреинов (KLKs), охватывающее самый крупный, эволюционно неизменный, кластер сериновых протеиназ человека, который не утрачивает генов, давно привлека­ет внимание исследователей. Уникальные свойства чле­нов семейства KLKs делают их идеальными для многих исследований [11]. KLK вовлечены в разные стадии раз­вития рака и его прогрессии и, как показали испытания специфического антигена простаты - PSA, проявили себя как мощные опухолевые маркеры [11][12]. В клетках рака простаты экспрессия калликреинов-3 и -4 (KLK-3 и KLK- 4) приводит к потере Е-кадгерина и индукции мезенхим­ной экспрессии маркера Виментина, как отличительного признака эпителиально-мезенхимальных переходов, что является важным шагом в изучении метастазирования [12]. Существуют убедительные доказательства того, что члены семейства KLKs дублируют активность друг дру­га попарно и согласованно регулируются в нормальных биологических жидкостях и тканях, в то же время они же часто демонстрируют общие закономерности аномаль­ной экспрессии в патологии [10][11][13]. Потенциал KLKs как биомаркеров рака стал известен после демонстрации ассоциации между уровнями KLK3 или PSA (простат- специфического антигена) и прогрессией рака предста­тельной железы [11][12]. Кроме того, постоянно расту­щее число исследований in vitro и in vivo демонстрирует функциональное участие KLK в процессах, связанных с раком [10][11][12][13][14][15][16][17].

В коже кинины участвуют в клеточной пролиферации в качестве комитогенов, а также участвуют в процессах, распространяющих воспаление и боль [11]. Сенсорные изменения, связанные с различными моделями нейропа­тической боли, всегда связаны с кининовой системой. Ра­нее Ferreira J. et al. [18] получили данные, доказывающие, что именно рецептор B1 играет решающую роль в кон­троле стойкой гипералгезии у мышей в результате воспа­ления, тогда как В2-рецептор играет лишь вспомогатель­ную роль в нарастании отеков. Это подтверждено Luiz et al. в более поздних исследованиях [5]. Werner M.F. et al. [19] показана высокая экспрессия рецепторов кининов B1 и B2 в кожных пробах задних лап мышей и образцах спинного нерва L4-L6 на 12-й день после операции одно­сторонней травмы спинного нерва. Рецептор кинина B1 участвует во множестве патофизиологических событий, связанных с раком, таких как воспаление и ангиогенез. Кроме того, опухоли, образованные из клеток, стимули­рованных В1-специфическим агонистом, проявили не­сколько особенностей снижения агрессивности, таких как меньший размер и инфильтрация воспалительных клеток в области опухоли, более высокие уровни провоспалительных цитокинов, вовлеченных в иммунный ответ против опухолей хозяина [20].

Передача сигналов брадикинином является наиболее мощным индуктором воспалительной боли, это доказа­но, например, при патологии вульвы в клинике, меланоме кожи в эксперименте [3][4][5]. В клинических исследованиях авторами установлено, что рецепторы брадикинина экс­прессируются на повышенных уровнях у онкологических больных, по сравнению со здоровыми, и контролируют­ся фибробластами, которые вырабатывают повышенные уровни провоспалительных медиаторов со стимуляцией брадикинином. Ингибирование экспрессии В1 или обоих брадикининовых рецепторов (В1 и В2) значительно сни­жало продукцию провоспалительных медиаторов. До­казано, что брадикинин активирует сигнализацию ядер­ного фактора основного воспалительного пути, тогда как ингибирование этого пути успешно устраняло медиаторный ответ. Ноцицептивные ответы на периферии, в ко­нечном счете, активируют и сенсибилизируют сигналь­ные болевые нейроны рогов спинного мозга, приводя к спонтанным ноцицептивным реакциям и гиперчувстви­тельности. В эксперименте на модели сингенной мелано­мы кожи B16F10 A.G. Maria et al. [4] сравнивали скорость развития меланомы и генерализации процесса у мышей с нормальным содержанием рецептора брадикинина В1 и его дефицитом, причем у последних обнаружено по­явление опухоли с более высоким уровнем изъязвления, снижением иммунного ответа, более высоким митоти­ческим индексом и более крупными метастатическими колониями.

Цель исследования: изучение уровня некоторых по­казателей ККС в ткани меланомы кожи и участков кожи, не связанных с опухолью, мышей-самок, в динамике ро­ста экспериментальной меланомы В16Ж10, воспроизве­денной на фоне хронической нейрогенной боли.

Материалы и методы

Работа выполнена на самках мышей линии С57ВР/6 (n=132) 8-недельного возраста с начальной массой 24-26 г. Животные получены из ФГБУН «Научный центр био­медицинских технологий «Андреевка» ФМБА (Москов­ская область)». В работе использовали клеточную линию мышиной, метастазирующей в легкие, меланомы В16/ F10, полученную из РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (г. Москва). Животные содержались при естественном ре­жиме освещения со свободным доступом к воде и пище. Все исследования проводились в соответствии с требо­ваниями и условиями, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» и приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.03 «Об утверждении пра­вил лабораторной практики».

Распределение животных: основная группа — 64 жи­вотных, которым меланому В16/F10 воспроизводили по­сле создания модели хронической боли, и контрольная группа — 22 животного с воспроизведенной моделью хронической нейрогенной боли без перевивки опухоли. В группу сравнения (стандартная модель меланомы) вош­ли 27 животных с перевивкой меланомы В16/F10 в той же дозе и объёме, что и в основной группе, но без воспроиз­ведения модели хронической боли. Результаты сравнива­ли с данными, полученными при исследовании кожи 19 самок интактных мышей.

Все манипуляции с животными производили в боксе. Инструменты, посуду, руки дезинфицировали общепри­нятым способом. Каждому животному вводили ксилазолетиловый наркоз: за 10 минут до основного наркоза с целью премедикации животному внутримышечно вво­дили ксилазин (препарат Ксила) в дозе 0,05 мл/кг массы тела (по инструкции), затем Золетил-50 в дозе 10 мг/100 г массы тела. После наступления медикаментозного сна ассистент фиксировал мышь в положении на животе, удалял шерсть сзади в районе проекции седалищных не­рвов и смазывал кожу 70% спиртом. Экспериментатор в стерильных условиях выделял седалищный нерв, накла­дывал на него лигатуру, ушивал рану послойно и обраба­тывал шов 5% спиртовым раствором йода. Через 2 недели после заживления операционной раны подкожно вводи­ли 0,5 мл взвеси опухолевых клеток мышиной меланомы В16/F10 в физиологическом растворе в разведении 1:10. Для этого, соблюдая все условия асептики, описанные выше, ассистент фиксировал мышь спиной кверху, пред­варительно сбрив шерсть и обработав кожу 5% спир­товым раствором йода чуть ниже правой лопатки. Экс­периментатор рукой в стерильной перчатке захватывал кожную складку, в центре которой прокалывал кожу и вводил опухолевую взвесь. Затем извлекал иглу, место введения плотно прижимал ватным тампоном, смочен­ным в 70 % спирте с небольшим добавлением йода, на 1 минуту, чтобы исключить вытекание вводимой взвеси. При стандартной перевивке опухоль появляется в 100 % случаев, достаточно быстро растёт и на 12-16 сутки роста метастазирует, преимущественно гематогенно, в легкие (60-90 %), реже — в печень и селезенку [21].

Через 1, 2 и 3 недели эксперимента животных из групп сравнения и основной быстро декапитировали, все про­цедуры проводили в соответствии с международными правилами работы с животными (European Communities Council Dirertive, 86/609/EEC). Опухоль и кожу выделя­ли сразу после декапитации. Из тканей получали 10% цитозольные фракции, приготовленные на 0,1М калий- фосфатном буфере рН 7.4, содержащем 0,1 % Твин-20 и 1 % БСА, в которых с помощью стандартных тест-систем методами иммуно-ферментного анализа определяли уро­вень кининогена, прекалликреина, KLK-1 и KLK-14.

Статистическая обработка материала проводилась с помощью программы Statistica 10 c определением сред­них значений с указанием стандартных отклонений. Значимость различий средних показателей оценивалась с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона. Суще­ственными считали различия при p<0,05. Анализ корре­ляции между параметрами определяли по коэффициенту линейной корреляции Пирсона «r», корреляцию считали достоверной при р<0,05. При этом соблюдались общие рекомендации для медицинских исследований.

Результаты

Установлено, что нейрогенная хроническая боль при­водит к значимым изменениям некоторых показателей ККС в коже интактных мышей-самок. Так, уровень ки- ниногена был выше значений, полученных при исследо­вании кожи интактных животных (контроль), в 3,0 раза, прекалликреина - в 2,1 раза. При этом содержание KLK-1 было снижено в 2 раза, а KLK-14 - не имело достовер­ных отличий, от контрольных показателей (табл. 1: кожа, боль).

К окончанию 1 недели после перевивки опухоли на фоне хронической нейрогенной боли в коже мышей ос­новной группы с хронической болью резко возрастал уровень KLK-1 — в 2,7 раза, относительно контрольно­го показателя у интактных животных. Уровень KLK-14 увеличивался только в 1,3 раза (р<0,05). Это происходи­ло на фоне снижения содержания кининогена в 1,7 раза (р<0,05), относительно контрольного показателя у жи­вотных с нейрогенной болью. В этот же срок исследова­ния изменения уровня прекалликреина не обнаружено.

В коже мышей группы сравнения через 1 неделю по­сле перевивки меланомы найдены иные изменения. Уро­вень калликреинов, в отличие от показателей у животных основной группы, снижался относительно соответствую­щего контроля: KLK-1 — в 2,7 раза, а KLK-14 — в 1,4 раза (р<0,05). Содержание кининогена в коже животных груп­пы сравнения в этот срок исследования, также, в отличие от показателей у животных основной группы, увеличива­лось в 1,5 раза (р<0,05). Сходным с показателями основ­ной группы мышей было только неизменное, относитель­но контроля, содержание прекалликреина (табл. 1).

Через 2 и 3 недели после перевивки только в коже мышей группы сравнения уровень кининогена оставал­ся без изменений, относительно предыдущего срока ис­следования (табл. 1). В коже мышей основной группы количество кининогена через 2 недели было ниже, чем в предыдущий срок исследования в 1,8 раза и оставалось на этом же уровне после 3 недель роста опухоли.

Прекалликреин через 2 недели после перевивки ме­ланомы В16/Б10 мышам основной группы оставался на прежнем уровне, а через 3 недели возрастал в 1,4 раза, относительно всех предыдущих сроков и контроля интактных животных с нейрогенной болью (табл. 1). В коже мышей группы сравнения прекалликреин снижался че­рез 2 недели в 1,7 раза и возрастал к концу 3-й недели в 3,6 раза, относительно предыдущего срока исследования.

KLK-1 в коже мышей основной группы последова­тельно снижался: в 3,8 раза к концу 2 недели и в 1,6 раза к концу 3 недели относительно предыдущих сроков из­мерения. В конечном итоге его количество было снижено в 4,5 раза относительно интактной кожи и в 2,3 раза от­носительно данных кожи контрольных животных с ней­рогенной болью. В коже мышей группы сравнения через 2 недели роста меланомы В16/Б10 количество KLK-1 не изменилось по сравнению с 1-й неделей, а через 3 недели увеличилось в 2,0 раза относительно данных 2 недели.

KLK-14 в коже мышей основной группы через 2 не­дели роста меланомы В16/Б10 сохранил тенденцию к уве­личению (на 14,4 %, р=0,05), а через 3 недели его количе­ство возросло в 1,6 раза относительно данных 2 недели и было выше соответствующего контроля в 2,2 раза. В коже мышей группы сравнения через 2 недели уровень KLK-14 снизился в 1,2 раза, а после 3 недель роста опухо­ли вновь соответствовал данным 1 недели, что было в 1,5 раза ниже соответствующего контроля.

В ткани опухоли меланомы В16/Б10 мышей основной группы через 1 неделю после перевивки меланомы В16/F10 найдено падение уровня кининогена в 2,0 раза и пре­калликреина — в 3,3 раза относительно соответствующего контроля (интактных животных с нейрогенной болью). При этом возросли KLK-1 — в 1,9 раза (р<0,05) и KLK-14 — в 3,1 раза (табл. 2). Как упоминалось, в группе сравнения в этот срок исследования опухоли не выявлены.

Через 2 недели эксперимента в ткани опухоли мела­номы В16Ж10 у мышей основной группы состояние всех изученных компонентов ККС достоверно не изменялось, относительно показателей в предыдущий срок исследо­вания. В этот срок в ткани опухоли животных группы сравнения найдено увеличение содержания кининогена в 2,0 раза относительно соответствующего контроля и KLK-14 - в 8,6 раза (табл. 2).

Через 3 недели роста опухоли в ткани меланомы жи­вотных основной группы вновь не обнаружено измене­ний исследованных показателей ККС, относительно пре­дыдущих сроков исследования.

В то же время, в ткани меланомы В16Ж10 у мышей группы сравнения найдены достоверные изменения не­которых показателей ККС. Так, уровень кининогена че­рез 3 недели после перевивки в опухоли возрос в 4,0 раза относительно предыдущего срока исследования и в 8,0 раз относительно показателя у интактных контрольных животных (табл. 2). В это же время содержание прекал­ликреина снизилось в 1,4 раза (р<0,05). Уровень KLK-14, хоть и снизился в 1,9 раза (р<0,01), относительно пре­дыдущего срока, однако оставался в 4,6 раза выше кон­трольных величин интактных животных.

Наблюдения, сделанные в ходе эксперимента, пока­зали, что влияние хронической боли на развитие пере­вивной меланомы В16Ж10 характеризовалось несколь­кими признаками. Опухоли в коже животных основной группы появлялись раньше, уже через 1 неделю после перевивки, имели двухфокусный рост, метастазирование — 100%, помимо традиционных мишеней (печени и легких), в нетрадиционные органы, а именно в сердце и матку. У мышей группы сравнения опухоли появлялись через 2 недели, метастазы регистрировались только через 4 недели. Сокращались сроки жизни животных: средняя продолжительность жизни для мышей основной группы составляла 19,17±1,35 дней, в группе сравнения первая смерть наступила на 24 сутки, а средняя продолжитель­ность их жизни составила 30,25±1,67 дня.

Обсуждение

Понимание механизмов, лежащих в основе хрони­ческих болевых состояний, станет серьезным шагом в развитии новых методов лечения, предназначенных специально для конкретных механизмов хронической боли, влекущей за собой пластические изменения в цен­тральной нервной системе, вызванные повышенной ак­тивностью в ноцицептивных первичных афферентных нервных волокнах. Однако до недавнего времени о ме­таболических изменениях, лежащих в основе этих очень длительных изменений возбудимости первичных афферентов, связанных с хроническими болевыми состояни­ями, известно мало.

Кинины являются мощными эндогенными алго- генными пептидами, и их роль в передаче боли широко обсуждалась [3][4][10][11][22]. После воздействия калликре- инов на кининоген и образования кининов последние ре­ализуют свои действия через активацию двух подтипов GPCR, называемых рецепторами B1 и B2 [23]. Брадики- нин является ведущим алгогеном и ключевым медиато­ром воспалительной гипералгезии. Внутримышечное введение брадикинина может вызвать боль и модифици­ровать восприимчивые поля нейронов дорсального рога к вредным раздражителям [3][4][15]. Таким образом, брадикинин может быть важным фактором возникновения и развития хронической боли.

Известно, что KLK-1 является более широко пред­ставленной кининогеназой, чем остальные члены семей­ства KLKs, и единственным клеточным калликреином с абсолютно специфичной кининогеназной активностью, а также высокоактивным адаптогеном к усиленному протеолизу [11][24]. Его ферментативная деятельность сводится к высвобождению брадикинина из низкомоле­кулярного кининогена, который, в свою очередь, соеди­няется со специфическим G-белком поверхностных кле­точных рецепторов [3]. Хроническая нейрогенная боль, как показывают результаты настоящего исследования, не вызывала увеличения образования брадикинина в коже интактных самок мышей с перевязанными седалищными нервами, так как уровень кининогена регистрировался втрое выше, чем у здоровых мышей (без нейрогенной боли), а KLK-1, напротив, вдвое ниже. Брадикинин яв­ляется острофазовым полипептидом, поэтому неуди­вительно, что хроническая боль в исследованные сроки не сопровождалась увеличением его содержания в коже животных. Вместе с тем, повышенное содержание прекалликреина на фоне сниженного уровня KLK-1 свиде­тельствовало об усилении его синтеза под действием хро­нической боли.

Рак и иммунные клетки в области расположения опу­холевых масс высвобождают несколько нейроиммунных медиаторов, которые взаимодействуют с различными ре­цепторами на периферических ноцицептивных нервных терминалах для развития аномального выделения и ги­первозбудимости. Кроме того, опухоли, растущие вбли­зи периферических нервов, могут поставить под угрозу целостность нерва, вызывая невропатическое состояние, сопровождающееся постоянной болью, гипералгезией или аллодинией. Оба эти действия опухолей на пери­ферический нерв могут привести к центральной сен­сибилизации, что еще больше повысит эффективность ноцицептивной передачи через спинной мозг и воспри­ятие спонтанной и прорывной боли [7]. Брадикинин, как продукт метаболизма ККС, находящийся на первом месте в ряду алгогенов, является одним из важнейших медиаторов воспаления [3][4][10]. Наличие связи между воспалением и раком было предположено еще в начале века [25], а в последнее время воспаление считается при­знаком рака [26], но конкретная роль иммунных клеток в области опухолей до сих пор полностью не выяснена. Ка­саясь медиаторной роли кининов, следует отметить по­лиморфизм их биологического действия и клинических проявлений, возникающих при активации калликреина: они повышают внутрикапиллярное и венозное давление, усиливают экссудацию, стимулируют пролиферацию Т-лимфоцитов, продукцию ими лимфокинов, усилива­ют пролиферацию фибробластов, синтез коллагена, тем самым стимулируя пролиферацию, наконец, взаимодей­ствуют с ноцирецепторами.

Следует подчеркнуть, что свободные кинины непо­средственно вызывают хемотаксис и дегрануляцию лей­коцитов, усиливают синтез простагландинов многими типами клеток, а также высвобождение гистамина из туч­ных клеток [3][4], что также усиливает болевую реакцию. Агонисты рецептора кинина B1 индуцировали дозоза­висимую секрецию нейтрофилами KLK1, KLK6, KLK10, KLK13 и KLK14 в культуральную среду [27]. Авторы из­учали экспрессию и биорегуляцию KLKs в человеческих нейтрофилах и рецептор B1, с точки зрения, индуцирует ли стимуляция с помощью кининового рецептора В1 их секрецию. Методом проточной цитометрии авторами установлено, что нейтрофилы экспрессируют только KLK1, KLK4, KLK10, KLK13, KLK14 и KLK15. При модели­ровании меланомы В16/Б10 увеличение KLK-14 наблюда­ли и в коже, и в ткани опухоли мышей основной группы. В исследовании Paterson C.J. et al. [15] найден надежный и неинвазивный метод оценки алгогенных эффектов брадикинина у людей. Авторы смогли разделить несколько различных эффектов брадикинина, включая эффекты агонистов B1- и В2-рецепторов. Учитывая литературные данные и настоящие результаты, увеличение расхода кининогена и количества KLK1 и KLK14 в процессе роста мышиной меланомы B16F10 на фоне хронической нейро­генной боли свидетельствует об увеличении количества свободных кининов как в опухоли, так и в коже, непо­средственно не связанной с опухолью, с реализацией их биологических свойств. Tiphaine Delaunay et al. [10] уста­новлены коррелятивные связи экспрессии калликреинов со степенью агрессивности меланомы человека, в частно­сти, клеточной миграцией и глубиной инвазии.

Итак, очевидно, что перевивка меланомы B16F10 на фоне хронической нейрогенной боли вызывала в коже мышей основной группы усиленное образование брадикинина, о чем свидетельствует прогрессивный расход ки- ниногена и KLK-1 в динамике роста меланомы, начиная со второй недели после перевивки опухоли. KLKs име­ют различные паттерны экспрессии и физиологическую роль, связанную, в том числе, со злокачественными про­цессами, такими как регуляция роста клеток, ангиогенез, инвазия и метастазирование [10][16].

Показано, что калликреины и сами поддерживают ангиогенез путем прямого или опосредованного разру­шения внеклеточного матрикса [11]. Доказано также, что одновременно возникают перекрестные реакции между известными протеолитическими путями и калликреиновыми каскадами, с акцентом на активацию плазмина и ее последствия, например, при раке простаты [28]. Ehrenfeld P. et al. [29] показано, что агонисты рецептора B1 действу­ют как функциональный стимул для секреции KLK-1, события, предшествующего производству кининов и клеточной инвазии. Авторами исследована возможность экспрессии истинных кининов тканевым KLK-1 из кле­ток рака молочной железы, в дополнение к стимуляции рецептора B1. В этом же исследовании показано, что стимулирование клеток рака молочной железы аналогом брадикинина вызывала высвобождение металлопроте- иназ (ММП-2 и ММП-9) и увеличивала пролиферацию клеток. В настоящем исследовании количество KLK-1 в неповрежденной коже возрастало к концу 1 недели после перевивки меланомы В16/F10 на фоне хронической боли с последующим его истощением и накоплением в опухо­ли с максимумом в конце 3 недели. Правомерно предпо­ложение о том, что KLK-1 принимает непосредственное участие в росте меланомы и образовании ее сосудистой сети. Возможно также предположение о том, что опухоль меланомы может «использовать» эндогенные KLK для своего роста, ангиогенеза и прогрессии.

Это предположение подкрепляется динамикой KLK- 14 (специфичного для кожи): в неповрежденной коже мышей основной группы его количество устойчиво рас­тет, а в опухоли, увеличившись на 1 неделе, стабилизи­руется. Еще C.A. Borgono et al. [13] показано, что KLK14 является прямым участником нескольких направлений прогрессирования опухоли, включая рост, инвазию и ан­гиогенез. В обзоре Pavlopoulou A. еt al. [11] подчеркивает­ся роль калликреинов в развитии различных видов рака: калликреины «вовлечены в разные стадии развития рака и его прогрессии и, как показали испытания PSA (про­статический специфический антиген — KLK-3, прим. автора), проявились как важные опухолевые маркеры». Увеличение активности KLK-14 приводит к усилению протеолиза белковых субстратов кожи и непосредствен­ной активации ММП-9, которая разрушает коллаген IV типа и другие компоненты базальной мембраны [30]. Белковые субстраты, которые образуют поверхностный слой кожи, развиваются совместно с их специфическими ферментами (KLK), поскольку последние играют важную роль в обновлении эпидермиса [11].

В обзоре Kontos C.K. et al. [14] изложен современный взгляд на состояние KLKs, как опухолевых маркеров. Ав­торами подчеркивается, что экспрессия различных KLKs прямо связана с клинико-патологическими параметрами онкологических больных. Несколько KLKs выполняют значительную прогностическую роль, благоприятную или неблагоприятную, при различных злокачественных опухолях, начиная с PSA, который теперь наиболее ши­роко используется, как биомаркер, в клинической прак­тике. Остальные члены семейства KLKs также считаются очень перспективными биомаркерами для индивидуали­зации терапии рака, особенно для мониторинга и про­гнозирования реакции пациента на химиотерапию.

В обзоре Avgeris M., Scorilas A. [17] обобщена роль KLKs в физиологии и патологии человека, особое вни­мание уделялось раку простаты и кожным заболева­ниям. Авторами обсуждались последние достижения в развитии терапии на основе регуляции KLKs. Под­черкивается, что большое количество разнообразных высокоэффективных ингибиторов-регуляторов KLKs, аналогичных эндогенным или с небольшими отличиями, уже синтезировано. Обнадеживающие результаты были задокументированы при использовании вакцин и имму­нотерапии на основе KLKs, а также активации зимогенов лекарственных средств, опосредованной KLK. Критиче­ская роль семейства KLKs во многих патологиях человека подчеркивает важность KLK как привлекательных моле­кулярных мишеней для разработки новых терапевтиче­ских средств и схем лечения.

В обзоре Kryza T. et al. [12] всесторонне рассмотрены биохимические особенности тканевых калликреинов, их функциональная роль в канцерогенезе, а также послед­ние разработки и успешность терапии, «управляющей» калликреинами в противодействии прогрессированию рака. Потенциал семейства KLKs как биомаркеров рака теперь хорошо известен, после демонстрации ассоци­ации между уровнями KLK3 (PSA) и прогрессией рака предстательной железы.

В настоящем исследовании одновременный рост прекалликреина и кининогена в коже при моделировании нейрогенной боли указывает на радикальную перестрой­ку метаболизма ККС всего пораженного органа в процес­се формирования болевого синдрома. Далее, в динамике роста меланомы B16F10 на болевом фоне, в коже количе­ство прекалликреина оставалось высоким с достоверным увеличением к концу наблюдения. В опухоли, начиная с 1 недели, содержание прекалликреина было снижено с достоверным повышением, не достигающим нормы, в по­следующие сроки наблюдения.

Таким образом, представленные данные доказывают угнетающее влияние хронической нейрогенной боли на процессы адаптации и защиты организма, в котором раз­вивается злокачественная опухоль. Полученные резуль­таты, касающиеся содержания в коже и опухоли исследо­ванных компонентов ККС при росте меланомы B16F10 на фоне нейрогенной боли, могут иметь значение для кли­ники при выяснении молекулярного механизма развития меланомы и ее лечения, а также других онкологических заболеваний, при которых активность KLK повышена. Постоянно растущее число исследований in vitro и in vivo демонстрирует непосредственное участие KLK в процес­сах, связанных с раком. Эти соединения теперь счита­ются ключевыми в регуляции роста раковых клеток, их миграции, инвазии, химиорезистентности и, что важно, в посредничестве между раковыми клетками и другими клеточными популяциями микроокружения опухоли для облегчения прогрессирования рака. Функциональная роль KLK в развитии рака подчеркивает их потенциал в разработке новых противораковых подходов.

Результаты проведенного исследования должны счи­таться предварительными, так как необходимо дальней­шее изучение не только специфичных калликреинов, но и кининогенов, и рецепторов брадикинина В1 и В2, а также эндогенных ингибиторов протеолиза и других смежных систем в росте и метастазировании меланомы B16F10 на фоне нейрогенной боли. Понимание роли ККС в генезе этой опухоли может быть полезно для клиницистов, так как должно привести к новым терапевтическим подхо­дам и персонализации лечения.

Выводы

1. Хроническая нейрогенная боль вызывает ради­кальную перестройку метаболизма ККС в коже интактных мышей, а именно увеличение содержания кининогена, прекалликреина и снижение количе­ства KLK-1.
2. Перевивка меланомы B16F10 на фоне хронической нейрогенной боли сохраняет рост прекалликреина в коже, но увеличивает его расход в ткани опухоли одновременно с активацией KLK-1 (в коже вплоть до истощения) и KLK-14.