Уровни цитокинов у женщин постменопаузального возраста в зависимости от отдельных полиморфизмов генов VDR, COL1A1, LRP5

Введение

Остеопороз (ОП) — это хроническое систем­ное прогрессирующее метаболическое за­болевание скелета, которое характеризуется снижением минеральной плотности костной ткани и нарушением ее микроархитектоники, вследствие чего повышается риск возникновения переломов. Наиболее актуальным по распространенности, социальной и экономической значимости является постменопаузальный ОП.

В настоящее время основным объективным подходом в диагностике ОП является определение методом денси­тометрии минеральной плотности костной ткани, ко­торая существенно зависит от внешних и генетических факторов [1]. Причем вклад генетической составляющей в этиопатогенез заболевания достигает 60-80 % [2][3][4]. Выполненные исследования показали, что показатели мине­ральной плотности различных участков скелета у жен­щин постменопаузального возраста имеют ассоциации с отдельными полиморфизмами генов рецептора витамина D (VDR), 1-альфа цепи коллагена I типа (COL1A1), белка, связанного с рецептором липопротеинов низкой плотно­сти 5 типа (LRP5). Было установлено, что постменопау­зальный ОП в области поясничных позвонков L1-L4 име­ет ассоциации с генотипом GG полиморфизма rs1544410 гена VDR [5]. Остеопоротические изменения в зоне прок­симальных отделов правого и левого бедра, а также шеек правой и левой бедренных костей реже развиваются у женщин с генотипом СС и чаще у носителей генотипа СА и аллеля А полиморфизма rs1107946 гена COL1A1 [6]. Увеличенный риск развития постменопаузального ОП характерен для женщин, имеющих генотип GT и аллель Т полиморфизма rs1800012 гена COL1A1, тогда как генотип GG данного полиморфизма сочетается с низкой вероят­ностью формирования заболевания [7]. Кроме того, сре­ди женщин, имеющих ОП поясничных позвонков L1-L4 и левой бедренной кости, увеличена частота регистрации генотипа СТ и аллеля Т полиморфизма rs3736228, гено­типа GA и аллеля А полиморфизма rs4988321 гена LRP5, а среди здоровых женщин чаще регистрируются генотипы СС и GG вышеуказанных полиморфизмов [8].

Последние достижения в изучении патогенеза пост­менопаузального ОП свидетельствуют о ключевой роли в развитии заболевания иммунных факторов. Обусловлен­ные дефицитом эстрогенов изменения баланса цитокинов у женщин постменопаузального возраста вызывают угнетение остеобластогенеза, увеличение активности и количества остеокластов, что способствует усилению ре­зорбции костной ткани [9][10]. Учитывая генетическую составляющую в этиопатогенезе ОП и важную роль цитокинов в регуляции костного метаболизма, тем не ме­нее, к настоящему времени отсутствуют работы, направ­ленные на исследование особенностей статуса цитокинов у женщин постменопаузального возраста, имеющих раз­личные полиморфные варианты генов VDR, COL1A1 и LRP5.

Цель исследования: изучить сывороточные уровни провоспалительных и противовоспалительных цитокинов при постменопаузальном остеопорозе, а также их изменения в зависимости от полиморфизмов rs1544410 гена VDR, rs1107946 и rs1800012 гена COL1A1, rs3736228 и rs4988321 гена LRP5.

Материалы и методы

Работа выполнена в Донецком Национальном меди­цинском университете. Обследованы 180 женщин в пост­менопаузальном возрасте (60,0±0,77 лет). В исследование не отбирались женщины, принимавшие заместительную гормональную и антиостеопоротическую терапию, глю­кокортикостероидные препараты. Исключались также пациенты с наличием овариоэктомии, эндокринных и метаболических расстройств, гематологических заболе­ваний, неопластических состояний, хронических заболе­ваний почек и печени, аутоиммунной патологии, систем­ных заболеваний соединительной ткани, хронических воспалительных заболеваний.

Женщинам выполнялась остеоденситометрия пояс­ничных позвонков L1-L4, проксимальных отделов и шеек левой и правой бедренных костей методом двухэнерге­тической рентгеновской абсорбциометрии. Использо­вались денситометры «Discovery W QDR Series X-Ray Bone Densitometer» (HOLOGIC Inc., США) и «Prodigy» (GE Medical Systems LUNAR, США). Результаты выража­лись в виде показателей минеральной плотности кости и Т-критерия.

В образцах сыворотки крови женщин определялись уровни интерлейкинов (IL) -1β, -4, -6, -8, -10, -17А, фак­тора некроза опухоли альфа (TNF-α), гамма-интерферо­на (INF-γ), остеопротегерина (OPG), лиганда активатора рецептора ядерного фактора кВ (RANKL). Исследова­ния выполнялись с помощью иммуноферментных тест-систем производства «Вектор-Бест» (п. Кольцово, Ново­сибирская обл., РФ), «eBiosciences» (San Diego, CA, США), «Biomedica Medizinprodukte» (GmbH & Co KG, A-1210 Wien, Германия).

Тестирование полиморфизмов 283 A>G (BsmI, rs1544410) гена VDR, -1997 C>A (rs1107946) и 1546 (6252) G>T (Sp1 S>s, rs1800012) гена COL1A1, 3989 C>T (Ala- 1330Val, rs3736228) и 1999 G>A (Val667Met, rs4988321) гена LRP5 осуществляли методом полимеразной цепной реакции с использованием соответствующих наборов и амплификатора ДТ-96 производства «ДНК-Технология» (Москва, РФ).

Результаты

На первом этапе проведения статистического анали­за полученных данных была выполнена оценка уровней цитокинов в сыворотке крови женщин в зависимости от состояния их костной системы. Для этого, исходя из результатов остеоденситометрии, все обследованные были распределены в 3 группы - здоровые (n=37, пока­затели Т-критерия до -1,0 стандартных отклонений от пиковой костной массы), с остеопенией (n=84, значения Т-критерия ниже -1,0 до -2,5 стандартных отклонений) и ОП (n=59, Т-критерий равен -2,5 стандартных отклоне­ний и ниже). При этом контрольная группа, группы жен­щин с остеопенией и ОП существенно не отличались по возрасту (соответственно 59,0+1,71, 60,5+1,09 и 60,0+1,44 лет, P>0,05) и длительности постменопаузального пери­ода (соответственно 10,0+1,73, 10,0+1,09 и 12,0+1,22 лет, P>0,05).

Установлено, что пациенты с ОП, по сравнению с кон­трольной группой, характеризовались (табл.1) более вы­сокими значениями в сыворотке крови IL-1-β (P<0,001), IL-8 (P=0,048), IL-17А (P=0,002), TNF-α (P=0,031), RANKL (P=0,032) и сниженными уровнями IL-4 (P=0,027), IL-10 (P<0,001). Аналогичной направленности различия были выявлены также и между группами женщин с ОП и остеопенией по уровням IL-1-β (Р=0,017), IL-8 (Р=0,031), IL- 10 (Р=0,018), IL-17А (Р<0,001), TNF-α (Р=0,002), RANKL (Р=0,023). Необходимо отметить, что больные остеопенией также отличались от контрольной группы значениями IL-1-β (увеличение, Р=0,004) и IL-10 (снижение, Р=0,008).

Наряду с этим не было установлено особенностей трех групп женщин по сывороточным показателям INF-γ и OPG (P>0,05). Кроме того, не было обнаружено разли­чий между выделенными группами и по индексу OPG/ RANKL, значения которого у здоровых женщин и па­циентов с ОП и остеопенией составил соответственно 28,0+21,1, 25,1+6,65 и 23,1 + 16,6 (P>0,05).

Для изучения ассоциаций полиморфизма rs1107946 гена COL1A1 с уровнями цитокинов обследованные жен­щины были распределены в 2 группы. Отдельно были выделены женщины с генотипом СС (n=126), который в ранее выполненных исследованиях обнаруживал связь с низким риском развития ОП [6]. Вторую группу (n=54) составили пациенты с генотипом СА (n=46) и небольшое количество лиц, имеющих генотип АА (n=8). Аналогич­ным образом были выделены две группы женщин и по полиморфизму rs1800012 гена COL1A1, исходя из того, что увеличенный риск развития постменопаузального ОП имеет связь с генотипом GT и аллелем Т, а генотип GG, наоборот, ассоциирован с низкой вероятностью за­болевания [7].

Сравнительный анализ женщин с различными ва­риантами полиморфизма rs1107946 гена COL1A1 (табл. 3) показал, что лица, имеющие генотипы СА или АА, по сравнению с носителями генотипа СС имели более высо­кие уровни IL-4 (Р=0,006), IL-6 (Р=0,023), IL-8 (Р=0,023), IL-10 (Р=0,012), RANKL (Р=0,022). Женщин с генотипами GT или TT полиморфизма rs1800012 гена COL1A1 отли­чали от обладателей генотипа GG сниженные значения IL-10 (Р=0,007), OPG (Р=0,013), индекса OPG/RANKL (Р=0,042).

Следует отметить, что ни один из вышеуказанных полиморфизмов гена COL1A1 не показал ассоциаций (P>0,05) с показателями IL-1, Ж-17А, TNF-α, INF-γ. Не было обнаружено различий и среди женщин в зависимо­сти от полиморфизмов гена LRP5 (табл.4) как по концен­трациям вышеуказанных цитокинов, так и ряда других (IL-4, IL-6, IL-8, OPG, RANKL). Вместе с тем, лица с ге­нотипом GA полиморфизма rs4988321 имели более низ­кие значения IL-10, чем носители генотипа GG (Р=0,003). Аналогичное снижение содержания в сыворотке крови IL-10 было определено (Р=0,007) и у женщин, имеющих генотипы СТ или ТТ полиморфизма rs3736228.

Обсуждение

Таким образом, выполненные исследования демон­стрируют существенные изменения статуса цитокинов при постменопаузальном ОП, который характеризуются увеличением сывороточных концентраций провоспалительных цитокинов IL-1-β, IL-8, Ж-17А, TNF-α, RANKL и снижением уровней противоспалительных цитокинов IL-4, IL-10. Полученные результаты согласуются с совре­менными представлениями о роли иммунной системы в развитии постменопаузального ОП [9][10][11]. В настоя­щее время доказано, что снижение уровня эстрогенов в постменопаузу сопровождается усилением пролифера­ции и активацией Т-клеток, а также ингибированием их апоптоза. Вследствие этого увеличивается количество активированных Т-лимфоцитов и повышается продук­ция ими провоспалительных цитокинов. Итогом данных изменений является хроническая стимуляция остеокла­стов, приводящая к усилению резорбции костной ткани и развитию ОП. В связи с этим считают, что в патогенезе потери костной массы ключевую роль играют иммунные нарушения, а ОП называют хроническим иммуноопосредованным заболеванием [9][10].

Анализ уровней цитокинов в зависимости от генети­ческих маркеров показал, что те генотипы полиморфиз­мов генов VDR, COL1A1 и LRP5, которые в ранее выпол­ненных исследованиях показали связь с повышенным риском ОП [5][6][7][8], в большинстве своем обнаруживали ас­социации с увеличением концентраций провоспалитель­ных цитокинов и снижением противовоспалительных. И это естественно, так как вышеуказанные генотипы (ге­нотип GG полиморфизма BsmI гена VDR и др.) чаще ре­гистрируются именно среди больных ОП.

Вместе с тем необходимо отметить особенности цитокинового статуса женщин с некоторыми полиморфны­ми вариантами изученных генов. Так, была установлена связь полиморфизмов rs3736228 и rs4988321 гена LRP5 с изменением уровней всего лишь одного цитокина (IL-10), а полиморфизма rs1800012 гена COL1A1 — только двух цитокинов (IL-10 и OPG). Важно отметить, что до­стоверные ассоциации концентраций в сыворотке OPG было свойственны только с генотипами полиморфизма rs1800012 гена COL1A1. При этом изменений уровней OPG в зависимости от других изученных полиморфиз­мов, также как и от состояния костной системы женщин, установлено не было.

К настоящему времени возможные механизмы, кото­рыми можно было бы объяснить связи генотипов поли­морфизмов генов COL1A1 и LRP5 с изменениями иммун­ных показателей, остаются неизвестными. Не исключено, что роль данных полиморфизмов в развитии ОП даже и не обусловлена прямым их влиянием на продукцию цитокинов. А выявленные связи с уровнями цитокинов опосре­дованы другими причинами, обусловленными сложными взаимодействиями в системах «ген-ген», «ген-внешние факторы». Ведь ОП является полигенным заболеванием. В его этиопатогенезе участвуют многие взаимовлияющие друг на друга гены, фенотипические проявления которых реализуются под воздействием широкого спектра внеш­них факторов (наличие и выраженность дефицита эстро­генов, витамина D и кальция, гиподинамия, курение, ра­совые различия и т.д.). Подтверждением этому является мнение о том, что мутации в гене COL1A1, участвующем в образовании коллагена, являются причиной структур­но-функциональных изменений основного компонента соединительной ткани и тем самым способствуют разви­тию ОП. В частности, одной из таких мутаций является полиморфизм rs1800012 в гене COL1A1, который приво­дит к увеличению соотношения α-1 и α-2 цепей коллагена и, в конечном итоге, к ухудшению костной микроархи­тектуры и увеличению риска переломов [12][13].

Известно, что мутации гена LRP5 могут оказывать не­посредственное действие на функцию костных клеток, процессы костеобразования и резорбции костной ткани. Белок, связанный с рецептором липопротеинов низкой плотности 5 типа, который кодируется геном LRP5, яв­ляется важным фактором в реализации сигналов по ка­ноническому Wnt-сигнальному пути [14]. Канонический (β-катенин-зависимый) Wnt-сигнальный путь — один из важнейших молекулярных сигнальных путей, кото­рый регулирует эмбриональное развитие и дифференцировку клеток, в том числе клеток костной системы. Нарушения Wnt-сигнализации, которые могут быть об­условлены мутациями гена LRP5, в сторону увеличения сопровождаются повышением интенсивности костео­бразования, а в сторону уменьшения — снижением кост­ной массы и нарушениям скелета [15]. Вместе с этим, необходимо указать на важную роль канонического Wnt- сигнальному пути в регуляции не только костных клеток, но и клеток иммунной системы [16]. Исходя из этого, можно предположить, что влияние полиморфизмов гена LRP5 на риск развития ОП может быть опосредованно и через воздействие на функцию дендритных клеток, лим­фоцитов. В том числе показано, что снижение LRP5/6- опосредованной сигнализации в дендритных клетках приводит к усилению дифференцировки эффекторных Т-клеток, увеличению производства провоспалительных цитокинов и уменьшению продукции IL-10 [17][18][19]. Это согласуется с полученными нами результатами, демонстрирующими связь генотипа GA полиморфизма 1999 G>A (Val667Met, rs4988321) и генотипов СТ или ТТ по­лиморфизма 3989 C>T (Ala1330Val, rs3736228) гена LRP5 со снижением уровней в сыворотке крови IL-10.

Механизмы, посредством которых мутации гена VDR, в том числе полиморфизм BsmI, участвуют в развитии остеопоротических изменений до настоящего остаются дискутабельными. Предполагается, что аллели риска об­условливают снижение экспрессии данного рецептора [15], что сопровождается уменьшением регулирующих эффектов витамина D на клетку. Возникает картина де­фицита витамина D даже при его достаточном количе­стве. Результатом этого является угнетение геномных эф­фектов витамина, направленных на абсорбцию кальция в эпителии кишечника. Развивается и недостаточность непосредственных механизмов воздействия витамина на клетки костной системы, в том числе остеобласты [20]. Все это может быть важными звеньями патогенеза ОП. Кроме того, страдает и регулирующее действие витами­на D на иммунные клетки. К настоящему времени уста­новлена его важная функция в обеспечении иммунного ответа, в том числе в подавлении чрезмерной продукции провоспалительных цитокинов и повышении образова­ния IL-10 [21]. По всей видимости, наличие генотипа GG полиморфизма 283 A>G (BsmI, rs1544410) сочетается со снижением эффектов витамина D на клетки иммунной системы, что может сопровождаться теми изменениями в цитокиновом балансе, которые были выявлены в нашей работе, а именно увеличением уровней IL-1-β, RANKL, индекса OPG/RANKL и снижением показателей IL-10.

Заключение

Таким образом, установлено, что женщины с пост­менопаузальным остеопорозом характеризуются су­щественным (P<0,05) увеличением концентраций в сыворотке крови IL-1-β, IL-8, IL-17A, TNF-α, RANKL и снижением уровней IL-4, IL-10. Полиморфные варианты генов VDR, COL1A1 и LRP5, которые обнаруживали ассо­циации с развитием постменопаузального остеопороза, в большинстве случаев имели аналогичной направленно­сти ассоциации с изменениями уровней вышеуказанных цитокинов. Вместе с тем были обнаружены и особен­ности цитокинового статуса у женщин в зависимости от генетических полиморфизмов. Полученные данные отражают важные патогенетические аспекты постмено­паузального остеопороза, в том числе в зависимости от генетических факторов, и могут быть использованы для разработки индивидуализированных схем лечебно-про­филактических мероприятий.