Генетический профиль эмбрионов в программе вспомогательных репродуктивных технологий в Кузбассе (Кемерово) по результатам преимплантационного генетического тестирования

Введение

Бесплодие — заболевание, лечение которого является одним из актуальных аспектов в настоящей системе здравоохранения. Решение данной проблемы одно из ключевых направлений современной медицины. Так, бесплодие в Европе затронуло примерно 10% супружеских пар, в США частота его распространения колеблется от 8 до 18%, в Канаде — 17%, в Австралии — 15,4%¹. Число бесплодных браков на территории Российской Федерации варьируется от 8 до 17,5%. Частота бесплодия в Кузбассе составляет 20,3%, что в свою очередь превышает критический порог, установленный специалистами всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (15%). В рамках проведённого исследования 2010 г. установлено, что на территории Кузбасса, как и во всей России в целом, доминирует вторичное бесплодие (55,9%) [1]. Вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) — эффективный метод лечения бесплодия на сегодняшний день, который ежегодно становится более востребованным среди пар с нарушением репродуктивных функций. При этом количество циклов за счёт программ обязательного медицинского страхования ежегодно увеличивается. Так, в России за 2019 г. проведены 165 463 циклов ВРТ, что на 53 491 цикл больше по сравнению с 2015 г., не уступая по количеству проведённых циклов ведущим клиникам из Испании, Франции и Германии, где количество циклов за 2019 г. составило 137 276, 118 394, 107 136 соответственно². Тем не менее, несмотря на стремительное развитие ВРТ, около 30% беременностей, полученных путем ЭКО или ИКСИ, не завершаются родами³ .

Хромосомные аномалии (ХА) — одна из основных причин неудач при использовании ЭКО. Частота ХА у абортусов в I триместре при использовании ЭКО-ИКСИ составляет от 59,70 до 64,06% [2]. В исследовании Демиковой Н.С. с соавт. приведены данные, согласно которым риск развития хромосомных аномалий у плода возрастает с возрастом матери. Так, при возрасте от 20 до 34 лет риск развития ХА составляет 1,52 на 1000 рождений, а после 40 лет этот показатель увеличился до 13,34 на 1000 рождений [3]. Поэтому для профилактики переноса эмбриона без ХА в полость матки вовремя ЭКО целесообразно выполнять ПГТ при наличии медицинских показаний с учётом возраста и анамнеза супружеской пары.

Достижения в области преимплантационного генетического тестирования (ПГТ) привели к значительному усовершенствованию в практике (ВРТ), что позволяет центрам репродуктивной медицины переносить одиночные здоровые эмбрионы, сохраняя при этом высокие показатели продолжающейся беременности, снижая частоту выкидышей и количество многоплодных беременностей, связанных с использованием ВРТ. Преимущества проведения ПГТ на анеуплоидии (PGT-A) были подтверждены многочисленными рандомизированными контролируемыми исследованиями и метаанализами. По результатам исследований, ПГТ-А становится более распространённым в клиниках по лечению бесплодия во многих развитых странах. В 2016 г. сообщество зарубежных репродуктологов указало, что 31% всех циклов ВРТ включало ПГТ, а во многих иностранных клиниках этот показатель доходит до 50% [4]. В Росии, по данным регистра ВРТ 2021 г., частота использования ПГТ увеличилась до 10,4%, а в г. Кемерово она составила 7,8 %. ПГТ является крайне важным и динамично развивающимся направлением ВРТ, способствующим наступлению беременности без генетических и хромосомных патологий в циклах ЭКО.

Согласно рекомендациям МАРС (Междисциплинарной ассоциации специалистов репродуктивной медицины), исследование кариотипа эмбриона целесообразно при бесплодии, в случае неразвивающейся беременности после программ ВРТ и при синдроме привычной потери беременности для принятия правильного решения о ведении таких пациенток [5]. Исследование хромосомных аномалий при неразвивающейся беременности в Кузбассе проводилось в 2017 г., что даёт возможность осуществлять мониторинг в динамике за последние 7 лет. Участие генетических аномалий в патологии эмбриогенеза имеет достаточно высокий показатель. По данным различных литературных источников, до 70% беременностей на сроке шестой-восьмой недели содержали эмбрион с разными хромосомными аномалиями. Исследование, проведённое в Кузбассе в 2017 г. Волковым А.Н. с соавт., демонстрирует, что из всех хромосомных патологий эмбрионов в регионе половина приходится на анеуплоидии, среди которых доминирует: трисомии 16 хромосомы, моносомии Х хромосомы и триплоидии [6].

Цель исследования — изучить частоту и структуру хромосомных аномалий эмбрионов, полученных в рамках ВРТ у женщин Кузбасса с бесплодием.

Материалы и методы

В рамках проведённого исследования были обследованы 25 женщин, проходивших лечение с диагнозом «Бесплодие» с февраля 2022 по март 2023 гг. Всем участницам данной выборки проводилось ЭКО методом ИКСИ-ПИКСИ с выполнением ПГТ-А. Для исследования эмбрионов на наличие анеуплоидий выполнялась биопсия трофэктодермы бластоцист на 5-е сутки развития эмбриона. Данные получены за период с февраля 2022 по март 2023 гг. на базе ООО «Центр охраны здоровья семьи и репродукции Красная горка» с соблюдением этических норм в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека с поправками» (2013) и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утверждёнными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266.

Общее число ооцитов составило 204. Полученные яйцеклетки обрабатывались и культивировали in vitro одновременно с эякулятом. Оплодотворение выполнялось методом инъекции сперматозоида в цитоплазму ооцита — ИКСИ.

После проведения ИКСИ оценка количества оплодотворённых яйцеклеток в первые сутки составила 185 зигот. После оплодотворения эмбрионы культивировались в инкубаторе при температуре 37 °C и в атмосфере с повышенным содержанием CO₂ (6%). Число дробящихся эмбрионов на третьи сутки составило 152. На 5-е сутки дробления (срок переноса эмбрионов в полость матки) их число сократилось до 82. На 3-и и 5-е сутки выполнялась морфологическая оценка эмбрионов по Гарднеру. ПГТ проводилось методом ПГТ-А с применением технологии NGS, для его выполнения использовался прибор MiSeqillumine. Генетическое тестирование проводилось на базе клиники medical genomics (Москва).

Для исследования эмбрионов на наличие анеуплоидий на базе ЦОЗСР «Красная горка» выполнялась биопсия трофэктодермы бластоцист на 5-е сутки развития эмбриона, биопсировали эмбрион качеством не хуже 3ВВ по Гарднеру, суммарно таких эмбрионов получилось 58.

Статистический анализ данных был проведён при помощи пакета Statistica 10.0. С целью оценки нормальности распределения переменных (количественных), использовался тест Колмогорова-Смирнова. Анализ данных проведён с использованием блока непараметрической статистики. Между показателями непараметрических данных корреляция рассчитывалась с использованием коэффициента корреляции Пирсона для рангов. Для расчёта выборок использовался расчёт значения критерия Стьюдента, который основан на значении коэффициента корреляции Пирсона. Корректирование полученных результатов при учёте многочисленных сравнений проводили с помощью процедуры FDR (False Discovery Rate).

Результаты

Для оценки фертильности женщин важно учитывать уровень антимюллерова гормона. Несмотря на то, что средний показатель АМГ составил 2,6±1,74 нг/мл. в группе, у 40 % пациенток он был ниже отметки 1,2 нг/мл, что в свою очередь ведёт к снижению количества и качества ооцитов и существенно снижает благоприятный исход ЭКО. Говард Дж. Ли с коллегами в своем исследовании также провели взаимосвязь между уровнем АМГ, качеством ооцитов и эмбрионов. Они проанализировали 492 цикла ЭКО/ИКСИ у пациенток с низким уровнем АМГ (<1,1 нг/мл), где наблюдались более высокие показатели отмены цикла, меньшее количество ооцитов и более низкие показатели формирования эмбрионов I–II степени, но не было различий в частоте имплантации, а также в частоте выкидышей и живорождений [7]. Также стоит учесть, что в нашем исследовании 36% женщин имело беременность в анамнезе и из них только в 2 случаях были благополучные родоразрешения. 12% женщин впервые вступали в протокол ВРТ с применением ПГТ по медицинским показаниям. А 52% женщин имели неудачные попытки ЭКО.

Поскольку, эмбрион — это «продукт» слияния мужских и женских половых клеток, то невозможно не учитывать качество сперматозоидов, участвующих в оплодотворении. Для оценки качества эякулята выполнялась спермограмма. Оценка параметров производилась в соответствии с нормативами ВОЗ⁴. В ходе проведения исследования эякулята у 48% мужчин выявлена нормозооспермия, в то время как у 52% мужчин наблюдалась патоспермия. Среди пациентов с диагнозом «Патоспермия» отмечались такие виды осложнений, как астенозооспермия (снижение подвижности сперматозоидов) — 53,85 %; тератозооспермия (наличие большого числа сперматозоидов с изменённой морфологией) — 15,38 %; криптозооспермия (низкое число сперматозоидов) — 7,69 %; олиго-астено-тератозооспермия (сочетание целого ряда патологий в эякуляте) — 23,08 %). Необходимо учесть, что общая результативность ПГТ-А анализа биоматериала составила 95,08 %. Трём образцам не проводилось исследование по причине деградации ДНК. Также стоит отметить тот факт, что все пары, включённые в исследование, имели в своём анамнезе диагноз «Бесплодие».

Опираясь на результат полученного цитогенетического исследования ПГТ-А было выявлено, что 60,3% (35) эмбрионов содержат ХА, что соответствует ранее полученным данным в Кузбассе (67,3 %) в исследованиях Волкова А.Н. и Рытенковой О.А. [8]. Среди эмбрионов с хромосомными патологиями выявлено 77,08% случаев с лишним числом хромосом или их отсутствие в какой-либо из пар (анеуплоидии). В 18,75% образцах наблюдался мозаицизм — сочетание в одном эмбрионе клеточных линий с различными хромосомными наборами. Значительно реже 4,17% встречались образцы с кратным увеличением числа гаплоидных хромосомных наборов (полиплоидия). В одном из крупных обзоров зарубежных коллег ретроспективно были проанализированы 724 бластоцистов в циклах ИКСИ. Средний возраст женщин, включённых в циклы, составил 38,5 лет. Результаты ПГТ-А эмбрионов, полученных путём ИКСИ получились следующие: эуплоидные эмбрионы (30%), анеуплоидные(43,1%), мозаичные (20,9%) [4].

Анализ спектра хромосомных нарушений эмбрионов, результаты которого представлены в таблице 1, показал, что трисомии по аутосомам являются самыми частыми геномными мутациями у человека. Трисомия по 16-й хромосоме наиболее часто встречается в выборке: 12,5% от общего числа хромосомных аномалий. Ещё одной часто выявляемой анеуплоидией стала моносомия по Х хромосоме (8,33%, кариотип 45, Х), которая совместима с жизнью и ассоциирована с формированием синдрома Шерешевского-Тернера в постнатальном периоде. При этом характер и степень выраженности пороков развития существенно различаются по клинике проявления.

В формировании анеуплоидии принимали участие 19 различных аутосом. В 9 случаях наблюдались моносомии, а в 10 — трисомии. Низкая частота каждой аномалии в отдельности даёт возможность сделать заключение, что данные мутации носят случайный характер, приводящий к анеуплоидии. Увеличение выборки помогло бы обнаружить прочие хромосомные аномалии.

Также была произведена сравнительная характеристика генетического профиля эмбрионов и их морфологических структур, представленная в таблице 2. Для этого было выполнено сопоставление морфологической оценки эмбрионов по системе оценивания Гарднера и результатов, полученных в ходе проведения ПГТ. В ходе исследования было установлено, что у большинства биопсированных эмбрионов оценка зрелости бластоцисты соответствовала BL3 («полной бластоцисте»), составив 63,8% от общего числа эмбрионов. Доля эмбрионов с хромосомными аномалиями в данной группе составили 59,5% от общей выборки.

Абсолютным показателем с 100%-ной долей эмбрионов без хромосомных патологий была зафиксирована у эмбрионов с оценкой по Гарднеру 5АА и 4АВ, которые в свою очередь оцениваются как эмбрионы отличного качества. При этом эмбрионы с морфологической оценкой 4ВВ (эмбрион высокого качества) имели в своём профиле 100%-ный показатель по наличию хромосомных аномалий. Во всех остальных случаях распространение эмбрионов с хромосомными аномалиями имело одинаковый профиль и соответствовало в среднем 60%, что в свою очередь соответствует статистике распространения ХА в выборке.

В ходе данной работы были получены следующие данные о том, что число женщин в группе, чей уровень АМГ >1,2 нг/мл составил 64%, в то время как у 36% он был снижен.

В когорте женщин, чей уровень АМГ был снижен, были получены всего 16 эмбрионов. В таблице 3 указано, что среди них 37,5% эмбрионов было эуплоидным, в то время как 62,5% эмбрионов имело ХА аномалии в своём профиле. Среди них доля эмбрионов с анеуплоидиями — 50%, мозаицизмом — 30%, полиплоидией — 20 %. При этом в группе женщин, где уровень АМГ был выше 1,2 нг/мл, были получены 45 эмбрионов: 40% эуплоидных и 60% эмбрионов с ХА. Среди ХА доля анеуплоидий составила 74,08%, мозаицизма — 22,22%, полиплоидий — 20%. Исходя из полученных результатов, мы можем сказать, что в когорте женщин, чей уровень АМГ был снижен, превалировала доля эмбрионов с мозаицизмом по сравнению с долей мозаицизма у женщин с высоким содержанием АМГ (18,7% по сравнению с 13,3%). Также уровень распространения триплоидии в когорте женщин с низким АМГ значительно превышает тот же параметр в группе женщин с высоким содержанием АМГ (12,5% против 2,2%). Но при этом доля распространения анеуплоидий выше в группе женщин с нормальным содержанием АМГ (44,5% — когорта женщин с нормальным уровнем АМГ, 31,3% — в когорте с низким уровнем АМГ).

В ходе исследования доля женщин высокого репродуктивного возраста (старше 35 лет) составила 72%, а доля женщин моложе 35 лет — 28%. Доля эмбрионов, которым проводилось ПГТ-А у женщин высокого репродуктивного возраста составило 60,3% от общего числа исследованных эмбрионов. Частота ХА эмбрионов у женщин старше 35 лет равна 57,1%, а доля эмбрионов без ХА составила 42,9%. При изучении структуры ХА эмбрионов у женщин высокого репродуктивного возраста было выявлено, что 70% эмбрионов анеуплоидные. Мозаицизм в данной группе составил 20%, а полиплоидия — 10%. Доля исследуемых эмбрионов у женщин моложе 35 составила 39,6% от общего числа исследованных эмбрионов. При исследовании генетического профиля эмбрионов, полученных у женщин моложе 35 лет, было выявлено, что у 60,8% имеются ХА, в то время как 39,2% эмбрионов было эуплойдным. Анализ структуры ХА эмбрионов женщин моложе 35 лет показал, что анеуплоидных эмбрионов было 57,15%, эмбрионов с мозаицизмом — 35,71%, с полиплоидией — 7,14%.

Наряду с оценкой качества полученных женских половых клеток (ооцитов) производилась оценка мужских гамет — сперматозоидов. Для выполнения данной задачи проводили качественное и количественное визуальное, физико-химическое и микроскопическое исследование спермы (эякулята). Всего было проведено 25 исследований эякулята в рамках подготовки к ВРТ на базе ЦОЗСР «Красная горка». При проведении спермограммы было выявлено, что у 52% пациентов нормоспермия, а у 48 % диагностировалась патоспермия.

В таблице 4 указано, что в когорте мужчин с нормоспермией было получено 32 эмбриона. Изучение структуры ХА эмбрионов в данной группе показало, что 28,1% эмбрионов было эуплоидным, в то время как 71,9% эмбрионов имело ХА. Анализ структуры ХА выявил, что 69,56% от всех нарушений плода составили анеуплоидии, на долю мозаицизма пришлось 21,74% эмбрионов, а нарушения кратного числа хромосом (полиплоидия) составили 8,7% от всех ХА.

Среди группы пациентов с патоспермией в ходе применения ВРТ были получены 26 эмбрионов. Анализ структуры ХА эмбрионов в когорте пациентов с патоспермией выявил, что 57,7% эмбрионов были эуплоидными. ХА в генетическом профиле имело 42,31% эмбрионов. Проведённый анализ выявил, что частота анеуплоидий в когорте мужчин с патоспермией составила 54,55%, мозаицизм имел долю распространения в 36,36%, а доля распространения полиплоидии составила 9,09%. Полученные результаты говорят о том, что, несмотря на нормальные показателей спермограммы, необходимо учитывать генетические особенности самих сперматозоидов, то есть оценить степень фрагментации ДНК сперматозоидов, поскольку даже при нормальной морфологической картине сперматозоидов, есть большая вероятность того, что при проведении процедуры ИКСИ, будет отобран сперматозоид с генетическими нарушениями, приводящими к ХА эмбриона.

Обсуждение

Для нашего исследования были отобраны пары, проживающие на территории Кузбасса в городской местности. Возраст пациенток на момент вступления в эмбриопротокол составлял от 26 до 47 лет, средний возраст — 37,2±5,9 лет.

Ещё одним довольно высоким показателем в исследованном материале эмбрионов стал мозаицизим участка хромосом. Частота распространения мозаицизма в выборке составила 18,75%, лишь немногим уступив моносомии по аутосомам. При изучении генетических аномалий эмбрионов, полученных в рамках ЭКО, в популяции Кузбасса отмечалось наличие полиплоидии, выраженных триплоидным набором хромосом. В отличие от иных хромосомных аномалий доля триплоидий в выборке была невысокой, составив 4,17% от общего числа аномальных кариотипов.

После проведённого анализа генетической и морфологической структуры эмбрионов можно предположить, что морфологическая оценка эмбрионов не гарантирует благополучный исход процедуры ЭКО, так как генетические нарушения эмбрионов, влияющие на имплантацию в полость матки и благополучное вынашивание плода, можно выявить только путём проведения цитогенетического исследования.

Уровень показателя АМГ имеет большое значение для оценки овариального резерва. Овариальный резерв отражает количество находящихся в яичниках фолликулов и зависит от физиологических и патофизиологических факторов. Было доказано, что уровень АМГ может быть фактором, определяющим не только число ооцитов, полученных в программе ЭКО, но и их качество [9]. Учитывая, что средней возраст женщин в выборке составил 37 лет было целесообразно провести анализ взаимосвязи возраста и ХА. Сравнивая относительные прогностические показатели АМГ и возраста, мы можем сказать, что эти критерии могут иметь важные клинические признаки для выявления пациентов, которым может быть необходимо проведение ПГТ-А. У пациентов <35 лет АМГ был более прогностически важным показателем в развитии анеуплоидных эмбрионов, при этом возраст не был прогностически важным. У пациентов ≥35 лет и возраст, и уровень АМГ значительно предсказывают риск развития анеуплоидных эмбрионов, хотя уровень АМГ был более прогностически значимым только у пациентов 35–37 лет, а возраст был значительно лучшим предиктором у пациентов ≥38 лет [10].

Взаимосвязь хромосомных аномалий и качества эякулята. У мужчин фертильность и объём эякулята также снижаются с возрастом, начиная с 35 лет: уменьшается подвижность сперматозоидов, чаще встречается нарушение морфологии. Экспериментальные данные демонстрируют, что от отцов в возрасте от 35 до 39 лет и старше рождается экспоненциально меньше детей по сравнению с более молодыми возрастными группами, даже с учётом возраста женщины. Исследование последних лет указывает на повышение уровня генетических нарушений в сперматозоидах у пациентов с различными формами нарушения репродуктивной функции Анализ генетических причин и последствий мужского бесплодия является необходимым для выбора тактики лечения бесплодия и имеет важное прогностическое значение для наступления беременности и родов. [11].

Заключение

В ходе проведённого исследования было выявлено, что 60% эмбрионов, полученных в рамках ВРТ. имеет хромосомные аномалии. Таким образом, можно сделать вывод, что 60% репродуктивных потерь в Кузбассе ассоциировано с хромосомными аномалиями. Среди всех ХА доминируют анеуплоидии с частотой в 77,08%. Среди анеуплоидий превалировала трисомия по 16-ой хромосоме (12,5%). Также было отмечено, что довольно высокая частота распространения мозаицизма, которая составила 18,75%. Тем самым, сравнивая показатели выявленной частоты хромосомных аномалий с результатами исследования зарубежных коллег, мы можем сказать, что уровни эуплоидных, анеуплоидных и мозаичных эмбрионов приблизительно равны.

Проведение ПГТ даёт возможность отделить здоровые эмбрионы без патологий от эмбрионов, содержащих ХА, что в свою очередь даёт возможность переносить в полость матки эмбрионы без ХА, таким образом, увеличивая частоту благополучных репродуктивных исходов.