Иммуномодулирующая терапия у пациенток с привычной неэффективной имплантацией

Введение

Основной лимитирующий фактор эффективности вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) возникает на этапе имплантации, так как 70% перенесённых эмбрионов не имплантируется [1].

Термин «привычная неэффективная имплантация» (ПНИ) необходим для того, чтобы выявить женщин с аномально низкой вероятностью наступления беременности на один эмбрион, предоставить прогностические данные и провести лечебные мероприятия для оптимизации имплантации при последующих переносах.

В настоящее время существует неоднородность критериев ПНИ. По данным международного опроса, 735 врачей [2], 84% клиницистов определили ПНИ на основании количества перенесённых эмбрионов, при этом самая большая группа (45%) определила ПНИ как неудачный перенос трёх свежих или замороженных эмбрионов. Интересно, что такие факторы, как расположение клиники (европейская или неевропейская), вид собственности (частная или государственная), коррелировали с используемым определением.

Консорциум преимплантационной генетической диагностики Европейского общества репродукции человека и эмбриологии определил привычную неэффективную имплантацию (ПНИ) как 3 и более неудачных переноса эмбрионов высокого качества или неудачный перенос ≥10 эмбрионов при множественных переносах [3]. Американское общество репродуктивной медицины не опубликовало критериев ПНИ. Проблема с определением ПНИ заключается в том, что существует множество факторов, влияющих на успех имплантации: возраст ооцитов и матки, длительность периода бесплодия, генетический статус эмбрионов (метод диагностики), системные заболевания, образ жизни (ожирение или курение), структурные аномалии матки, хронический эндометрит, наличие эндометриоза.

Роль иммунологических факторов в ПНИ — предмет многочисленных дискуссий. Ранняя репродуктивная недостаточность является наиболее частым осложнением беременности, при этом только одна треть зачатий достигает живорождения [4].

Рецидивирующая репродуктивная недостаточность связана с экспансией циркулирующих NK-клеток, ключевых клеток для материнской толерантности, децидуального ангиогенеза и роста эмбриона [5]. NK-клетки в матке (мNK) являются наиболее распространёнными лимфоцитами, обнаруженными в децидуальной оболочке во время имплантации и в первом триместре беременности. Они важны для раннего развития плаценты, особенно инвазии трофобласта и трансформации спиральных артерий. Однако неадекватная функция мNK связана с репродуктивной недостаточностью, такой как привычный выкидыш (ПВ) и ПНИ. Значительное повышение уровня мNK в эндометрии женщин с ПВ и ПНИ может указывать на лежащее в основе нарушение иммунной среды, достигающее кульминации в имплантации и/или недостаточности плацентации [6].

Существует обширная и постоянно развивающаяся литература по балансу Th-1/Th-2 во время беременности. Хотя определенная локальная провоспалительная среда необходима для имплантации эмбриона и ангиогенеза [7], считается, что доминирование провоспалительных цитокинов Th-1 неблагоприятно для наступления и течения беременности, а противовоспалительные цитокины Th-2 регулируют и улучшают ответ Th- 1 [8]. Показано, что у пациенток с ПНИ наблюдалось нарушение баланса про- и противовоспалительных цитокинов в периферической крови: повышение уровня провоспалительных цитокинов IFN-γ, IL-1β и IL-6; снижение уровня противовоспалительного цитокина TGF-β1 и повышенное соотношение провоспалительных/противовоспалительных цитокинов [9].

В течение последних 20 лет для лечения невынашивания беременности активно использовались различные способы иммунотерапии [10] (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор [11], ингибиторы ФНО-альфа, ингибитор лейкемии [12][13], глюкокортикоиды [14], интралипид [15][16][17][18], иммуноглобулины [19], иммуноцитотерапия [20][21][22][23][24][25]).

Рандомизированным контролируемым клиническим испытаниям в этой области не достает персонифицированного подхода.

Цель исследования — оценка влияния персонифицированной иммунотерапии на частоту наступления и вынашивания беременности у женщин с привычной неэффективной имплантацией.

Материалы и методы

На этапе подготовки к лечению по программе ВРТ (24 криопротокола в естественном цикле, 41 криопротокол с заместительной гормональной терапией без блокады гипофиза) проведено рандомизированное контролируемое проспективное иммунологическое исследование 65 пациенток 25–40 лет с ПНИ (основная группа). Учитывая эмоциональный фактор неэффективных циклов ВРТ, финансовые затраты, труднореализуемые для жителей нашего региона, длительную продолжительность бесплодия, мы включили в наше исследование супружеские пары с 2 (а не с 3) и более неудачными переносами эмбрионов высокого качества по классификации Д. Гарднера (1999)¹. У 8 пациенток эуплоидность эмбрионов была подтверждена методами предимплантационной генетической диагностики. Показаниями к проведению ВРТ были: трубно-перитонеальный фактор бесплодия у 12 (18,46%) пациенток, эндометриоз 2-3 степени у 21 (32,3%) женщины, мужской фактор бесплодия — 32 (49,23%) случая. Женщины с органической патологией эндометрия, аномалиями развития матки были исключены из исследования.

Контрольную группу составили 20 практически здоровых фертильных женщин 25–40 лет.

Данное клиническое исследование выполнено в соответствии с «Правилами клинической практики в Российской Федерации» и Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации и одобрено этическим комитетом ГОО ВПО «Донецкий национальный медицинский университет имени М. Горького» (протокол № 27/5-1 от 14.04.2021 г.).

Иммунологическое исследование включало анализ отдельных звеньев иммунной системы (T- и B-лимфоцитов (ЛФ)), а также функционального состояния нейтрофилов (НФ). В периферической крови определялись абсолютное число лейкоцитов и ЛФ; осуществлялось иммунофенотипирование лимфоцитов с индикацией абсолютного и относительного количества CD3+ (Т-лимфоцитов), CD3+CD4+ (Т-хелперов), CD3+CD8+ (Т-цитотоксических клеток/супрессоров), CD3+CD20+ (В-лимфоцитов), CD16+ (NK-клеток), а также иммунорегуляторного индекса (Т-хелперы/Т-супрессоры) (CD3+4+/CD3+8+) в прямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител (МКА) («Becton coulter», Франция) с последующей микроскопией микроскопом (Granum R50) с люминесцентной насадкой (Granum F2). О секреторной активности B-ЛФ судили по концентрации сывороточных иммуноглобулинов (Ig) классов G, A, M методом ИФА («Гранум», Украина). Для определения степени тяжести и активности иммунопатологического процесса в сыворотке крови нефелометрическим методом измеряли уровень общих циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Метод основан на нефелометрии разной растворимости мономеров Ig в составе иммунных комплексов при наличии в среде полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000). Интенсивность кислородозависимого метаболизма нейтрофилов (НФ) изучалась в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) в спонтанном и индуцированном суспензией Serratia marcescens (2*10⁹/мл) НСТ-тесте. При оценке фагоцитарной способности НФ определяли процент клеток, проявивших фагоцитарную активность (ФА) и среднее количество частиц латекса, поглощенных одним НФ (ФЧ).

Исследование проводили во II фазу менструального цикла (19–22-й день).

На этапе планирования программы криопротокола у пациенток исследовались показатели системного иммунитета и в зависимости от выявленных отклонений в иммунном статусе назначались 1, 2 либо 3 индивидуальных курса иммуномодулирующей терапии с учётом достижения положительной динамики или в случае неэффективной последующей имплантации. Интервал между курсами иммунотерапии составлял 6–12 мес. Один курс индивидуальной иммунотерапии получили 37 женщин, два курса потребовались 19 лицам, три курса получили ещё 9 пациенток.

В зависимости от выявленных отклонений в иммунограмме назначались следующие иммуномодуляторы: аминодигидрофталазиндион натрия, аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин диацетат, глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП, синтетический аналог структурного фрагмента оболочки (пептидогликана) бактериальных клеток), азоксимера бромид, аргинил-альфа-кислота рибонуклеиновая, диоксометилтетрагидропиримидин, а также витаминные комплексы, содержащие цинк, селен и медь.

Одной из причин дисфункции иммунной системы обследуемых женщин является хронический стресс, обусловленный проживанием в условиях военных действий. Страх повторной неэффективной попытки также являлся стрессовым раздражителем. Всем пациенткам оcновной группы был назначен седативный фитосбор.

Статистическая обработка данных проводилась методами вариационной статистики в программе «Excell 2016». Достоверность среднегрупповых показателей оценивалась по t-критерию Стьюдента для несвязанных (основная группа — контроль) и связанных (динамика в процессе лечения) выборок.

Результаты

Длительность периода бесплодия в основной группе была от 1 до 20 лет и в среднем составила 7 лет. Первичное бесплодие наблюдалось у 26 (40%) женщин основной группы, вторичное — у 39 (60 %.) Всего лишь у 10 (15,38 %) % женщин с вторичным бесплодием были роды в анамнезе, в 2 (3,08 %) случаях роды были патологическими. В группе женщин с ПНИ обращает на себя внимание высокая частота как искусственных (18–27,69%), так и спонтанных (14–21,54%) абортов, а также внематочных беременностей (16–24,6%).

Показаниями к проведению ВРТ были трубно-перитонеальный фактор бесплодия 12 (18,46%) пациенток, эндометриоз 2–3 степени 21 (32,3%) женщины.

У 32 (49,23%) супружеских пар наблюдался такой мужской фактор бесплодия, как патозооспермия (олиго-, астено-, тератозооспермия и их комбинации), не поддающийся коррекции. Концентрация сперматозоидов — менее ≤2 млн, подвижность — менее ≤5%, морфологически нормальных сперматозоидов — менее ≤5%. При данной патологии получить генетически родной мужчине эмбрион можно только методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ). У этих пар в анамнезе было 2 цикла ЭКО/ИКСИ с получением морфологически и генетически здоровых эмбрионов, но отсутствовала имплантация, и беременность не наступала. Это объясняется тем, что бесплодие у некоторых супружеских пар обусловлено не одной, а несколькими причинами.

Маточный фактор наблюдался у 54 (83,08%) женщин (гиперплазия, гипоплазия эндометрия, хронический эндометрит, подтверждённый иммуногистохимически, смещение окна имплантации), отклонения функции эндокринной системы выявлены у 41 (63,08%) женщины. Дисфункция щитовидной железы нарушена у 21 (32,31 %) женщины с ПНИ. Соматический анамнез был отягощён у 42 (64%) пациенток. Урогенитальные инфекции в анамнезе отмечало 73% женщин.

От 1 до 4 оперативных вмешательств на органах малого таза имели место у 41 (63,08%) женщины, эндоскопические оперативные вмешательства — у 37 (56,9%). Операции на яичниках были у 25 (38,46%) пациенток, оперативные вмешательства на маточных трубах — у 38 (58,46%).

У всех пациенток в анамнезе было 2 и более неэффективных циклов искусственного оплодотворения. У 57 (87,7%) из них в анамнезе были неэффективные циклы ВРТ, у 8 (12,3%) беременность была биохимической или закончилась самопроизвольным абортом.

Вышеперечисленные анамнестические данные могут явиться причиной хронического стресса и дисбаланса иммунной системы, а высокая частота репродуктивных потерь в анамнезе свидетельствует и о возможных изначальных отклонениях иммунной системы. Перед включением в программу ВРТ была проведена коррекция выявленной гинекологической и соматической патологии.

В основной группе по сравнению с контрольной отмечаются относительный (р=0,026) и абсолютный (р=0,018) лимфоцитоз, снижение процента популяции Т-лимфоцитов (СD3+) (р=0,000001), субпопуляции Т-хелперов (СD3+ СD4+) (р=0,00034), абсолютного числа Т-цитотоксических клеток/супрессоров (СD3+СD8+) (р=0,05), а также значения иммунорегуляторного индекса (р=0,010). При этом относительное (р=0,00004) и абсолютное (р=0,0001) число В-лимфоцитов (СD20+), а также NK-клеток (СD16+) (относительное — р=0,000001, абсолютное — р=0,000001) достоверно превышали значения контрольных показателей (табл. 1).

Имела место гипериммуноглобулинемия М (р=0,000001). При этом концентрации иммуноглобулинов А и G находились в пределах физиологической нормы. Общее количество циркулирующих иммунных комплексов было увеличено в сравнении с контролем (р =0,003).

Фагоцитарная активность нейтрофилов как показателя клеточного звена неспецифической реактивности организма у женщин основной группы не имела статистически значимой разницы с контролем (р=0,265). Однако, согласно данным спонтанного НСТ-теста, можно констатировать нарушение гомеостаза организма женщин с ПНИ (НСТ-тест спонт. — 27,25±1,15 %; контроль — 15,0±0,8 %; р=0,000001; ИАН спонт. — 0,33±0,019; контроль — 0,25±0,02; р=0,005). Остальные показатели находились в пределах физиологической нормы.

У 30% пациенток наблюдались сочетание снижения абсолютного числа СD3+ клеток и повышение числа NK-клеток.

В зависимости от ведущего звена нарушения иммунного гомеостаза клиническим иммунологом был предложен следующий алгоритм иммунотропной терапии.

При выраженном иммунодефицитном состоянии по гипо-Т-хелперному, гипо-Т-супрессорному типу со снижением относительного и абсолютного количества Т-клеток, низком значении иммунорегуляторного индекса назначались аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин диацетат по 1 мл 0,005% раствора внутримышечно 1 раз через 2-е суток (курс — 15 инъекций) либо ГМДП (10 мг 1 в сутки, курс — 10 суток) и аргинил-альфа-кислота рибонуклеиновая по 250 мг 4 раза в сутки (курс — 20 дней).

В случае истощения резервов для кислородзависимого метаболизма нейтрофилов пациентки принимали аминодигидрофталазиндион натрия в свечах 1 раз в 3 дня (курс — 15 дней) и диоксометилтетрагидропиримидин по 500 мг 4 раза в сутки (курс — 20 дней).

При дисбалансе иммунной системы, проявляющемся снижением Т-лимфоцитов (СD3+) и их субпопуляций с одновременным увеличением В-лимфоцитов (СD20+), NK-клеток (СD16+), гипериммуноглобулинемией А и М,а также активацией фагоцитарной активности с истощением резервных возможностей нейтрофилов к респираторному взрыву назначался азоксимера бромид по 12 мг 1 раз в сутки внутримышечно (курс — 15 инъекций) либо аминодигидрофталазиндион натрия в свечах 1 раз в сутки через 2 дня на третий (курс — 15 дней).

Все пациентки в течение 2 месяцев принимали комплекс витаминов и микроэлементов (в том числе содержащие цинк, селен и медь).

У большинства пациенток после первого курса наступало улучшение состояния, сопровождавшееся достоверным увеличением как доли (30,30±1,59%, до лечения — 24,16±1,27%, р=0,003), так и абсолютного числа (0,70±0,052 Г/л, до лечения — 0,53±0,04 Г/л, р=0,008) сниженной до лечения субпопуляции Т-хелперов (CD3+) (CD4+) (табл. 2, рис. 1).

Повторные курсы приводили к ещё более выраженной стимуляции Т-звена и достоверному увеличению доли Т-лимфоцитов (CD3+): после II курса — 52,86±3,51% (р=0,007), после III курса — 56,67±5,81% (р=0,017) (табл. 2, рис. 1).

Иммунорегуляторный индекс (CD3+4+/CD3+8+) имел тенденцию к повышению с каждым курсом иммунокоррекции, очевидно, за счёт статистически достоверного увеличения доли и абсолютного числа Т-хелперов (CD3+) (CD4+): I курс р=0,003; II курс р= 0,002; III курс р= 0,007.

Количество и функциональная активность В-лимфоцитов (СD20+), как и NK-клеток (СD16+), статистически достоверно не изменялось.

Достоверных изменений фагоцитарной активности нейтрофилов после первого курса лечения не происходило, однако их способность к «респираторному взрыву», по данным индуцированного НСТ-теста, статистически достоверно увеличивалась после первого курса иммунокоррекции (1,02±0,59, до лечения — 0,42±0,018, р=0,0001).

Стимуляция показателей фагоцитарной и метаболической активности нейтрофилов, рассчитанных на 1 клетку, также наблюдалась уже после первого курса иммуномодулирующей терапии (фагоцитарное число и индуцированный индекс активации нейтрофилов) (табл. 2, рис. 3).

Второй курс иммунокоррекции приводил к увеличению показателя спонтанного НСТ-теста (31,55±2,29 %, до лечения — 27,25±1,15 %, р=0,050 (табл. 2, рис. 2). Третий же курс, очевидно, истощал резервные возможности нейтрофилов, поскольку фагоцитарное число статистически достоверно снижалось (табл. 2, рис. 3).

Курсы индивидуальной иммунокоррекции с применением аргинил-альфа-кислоты рибонуклеиновой приводили к достоверной нормализации процента В-лимфоцитов (р=0,02), концентрации сывороточного Ig М (р=0,01), фагоцитарной активности нейтрофилов (р=0,04). Азоксимера бромид повышал сниженные Т-хелперы (СD3+4+) (р=0,05), а аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин диацетат увеличивал количество сниженных Т-лимфоцитов (СD3+) (р=0,02) и уменьшал до нормы увеличенные ЦИК (р=0,05).

После первого курса индивидуальной иммунокоррекции с последующей ЭКО/ИКСИ процедурой роды наступили в 51,35% случаев (19 из 37 женщин). Два курса привели к успешному родоразрешению 84,2% пациенток (16 из 19 женщин). Три курса позволили стать матерью всем 9 женщинам (100%).

Обсуждение

Данные научной медицинской литературы свидетельствуют о том, что общепринятые методы обследования супружеских пар не позволяют уточнить причину бесплодия в 20–30% случаев. Задачей нашей работы было предложить практическому врачу доступный, эффективный, малоинвазивный метод иммунодиагностики и иммунокоррекции у женщин с ПНИ, в анамнезе которых имелось большое количество лечебно-диагностических вмешательств.

Несмотря на то, что основные события, связанные с нарушением имплантации, происходят в эндометрии, показатели системного иммунитета периферической крови в определенной степени коррелируют с показателями местного иммунитета, а также определяют способность иммунной системы женщины обеспечить необходимую толерантность к «аллотрансплантанту» (эмбриону).

Повышенный уровень самопроизвольных абортов и неудачи с ЭКО в определённой степени обусловлены цитотоксичностью NK-клеток. Обнаружение увеличения уровня и активности циркулирующих NK-клеток полезно для выявления лиц с риском отсутствия имплантации эмбрионов и потери кариотипически нормальной беременности [26]. В.А. Загайновой и соавт. (2022) установлили обратную корреляцию между количеством беременностей в анамнезе и абсолютным содержанием активированных NK-клеток (rs=- 0,55; p<0,01) [27].

В нашем исследовании не были получены данные об эффективной коррекции числа NK-клеток (CD16+). Аналогичный вывод сделан в систематическом обзоре E. Von Woon et al. (2020), посвящённом оценке эффективности иммунотерапии для улучшения исходов беременности у женщин с привычным невынашиванием беременности или неудачей имплантации, специально отобранных на основе аномальных уровней и/или активности NK-клеток. Авторы заключают, что иммунотерапия может иметь некоторую пользу, но необходимы дальнейшие исследования с применением научно подтверждённых иммунологических биомаркеров в хорошо спланированных крупномасштабных рандомизированных контролируемых исследованиях [28].

Полученные нами данные согласуются и с метаанализом из Medline, Embase и Cochrane Library, проведённым A. Mekinian et al. (2016), о преимуществах иммуномодулирующих препаратов при привычных выкидышах и неудачах имплантации, когда была обнаружена умеренная польза прогестерона для рождения живого ребенка с отношением шансов 1,38. Антагонисты TNF-α в сочетании с низкими дозами аспирина, гепарина и внутривенных иммуноглобулинов обеспечили рождаемость в 71%, а назначение Г-КСФ закончилось живорождением в 82,8% [18]. K. Kolanska et al. (2021) сообщает, что применение иммуномодулирующей терапии и стероидов у пациенток с беременностью и необъяснимыми привычными выкидышами в анамнезе помогло улучшить акушерские исходы, поскольку удваивало шансы родить живого ребенка [29].

Заключение

Иммунный статус бесплодных женщин характеризуется вторичным Т-иммунодефицитом и значительной активацией как В-лимфоцитов, так и клеточных факторов неспецифической защиты организма (периферических NK-клеток (CD16+) крови и фагоцитов-нейтрофилов). Такие изменения иммунного профиля возникали у 100% пациенток с вторичным бесплодием и у 36,4% женщин с первичным бесплодием. В случаях, когда эти отклонения достигают критических величин, они негативно влияют на прогноз достижения беременности. Неудачи вспомогательных репродуктивных технологий при наличии эмбрионов хорошего качества обусловлены иммунологическим дисбалансом. Мужской фактор может сочетаться с отклонениями в иммунной системе женщины, что является одной из причин ПНИ. Это сочетание наблюдалось в нашем исследовании и было успешно откорректировано.

Персонифицированный подход к выбору иммуномодулирующих препаратов для каждой пациентки оптимизирует частоту имплантации, наступления и исход беременности.

Таким образом, повторные курсы персонифицированной иммуномодулирующей терапии у женщин с ПНИ в анамнезе привели к нормализации измененных показателей иммунитета и показали свою эффективность у 67,7% пациенток при наличии эмбрионов хорошего качества, увеличив шансы наступления имплантации, возможности вынашивания беременности и родов.