Динамическая оценка Т-лимфоцитов и гуморального иммунитета у пациентов с острым коронарным синдромом, болевших и не болевших COVID-19, в зависимости от содержания CD3⁺CD8⁺T-лимфоцитов

Введение

Острый инфаркт миокарда является одной из наиболее серьёзных причин смертности в мире и огромным бременем для мировой экономики. В процессе ишемии/реперфузионного повреждения миокарда важную роль играет модуляция иммунных клеток. Как известно, Т-клетки привлекаются к повреждению миокарда и одномоментно высвобождают провоспалительные и противовоспалительные цитокины. Т-клетки и макрофаги играют важную роль в поддержании сердечного гомеостаза и организации восстановления тканей [1]. COVID-19 повреждает многие звенья иммунной системы и особенно Т-лимфоциты [2][3]. Тяжёлый острый респираторный синдром, вызванный коронавирусом-2, может поражать сердечно-сосудистую систему, вызывая широкий спектр осложнений, включая острое повреждение миокарда. Миокард может быть повреждён прямой вирусной инвазией или косвенными механизмами, поддерживаемыми системным воспалением, иммуноопосредованным ответом и нарушением регуляции ренин-ангиотензиновой системы. Повреждение миокарда поражает около четверти пациентов с COVID-19, может проявляться даже при отсутствии предшествующих сердечно-сосудистых заболеваний и связано с более высокими показателями смертности и долгосрочными последствиями [4][5]. Патофизиологические механизмы отсроченных осложнений до сих пор плохо изучены, при этом наблюдается диссоциация между текущими симптомами и объективными показателями сердечно-лёгочного здоровья. Ожидается, что COVID-19 изменит долгосрочную траекторию многих хронических заболеваний сердца, которыми часто страдают люди, подверженные риску тяжёлого заболевания [6]. В обзоре Zuin M. et al. [7] показано, что перенесённый COVID-19 повышает риск развития острого инфаркта миокарда (ОИМ) [8]. Патофизиология тяжёлого острого респираторного синдрома коронавируса (SARS-CoV-2) характеризуется перепроизводством воспалительных цитокинов (IL-6 и TNF-α), что приводит к системному воспалению и синдрому полиорганной дисфункции, остро поражая сердечно-сосудистую систему. Повышенный риск инфаркта миокарда, молниеносный миокардит, быстро развивающийся с угнетением систолической функции левого желудочка, аритмии, венозная тромбоэмболия и кардиомиопатии, имитирующие проявления ОИМ с подъёмом сегмента ST (пST), являются наиболее распространенными сердечно-сосудистыми осложнениями, описанными у пациентов с COVID-19. Более того, тропизм SARS-CoV-2 и взаимодействие с ренин-ангиотензиновой системой через рецептор АПФ 2, возможно, усиливают воспалительную реакцию и повреждение сердца. Нарушения Т-клеточного иммунитета у пациентов с постковидным синдромом проиллюстрировано в работах К.С. Савчук и др. [9][10]. CD8⁺ Т-клетки накапливаются в некротическом миокарде при ОИМ. На данный момент остается неясным, способствуют ли CD8⁺CD28⁺ Т-клетки, составляя субпопуляцию CD8⁺ Т-клеток, повреждению миокарда. В исследовании Zang et al. [11] приняли участие 92 пациента с ОИМ и 28 здоровых субъектов контрольной группы. Уровень CD8⁺CD28⁺ Т-клеток в образцах периферической крови определяли методом проточной цитометрии. Также выявляли плазменный сердечный тропонин I и фракцию выброса левого желудочка. Долгосрочный прогноз пациентов оценивали по основным неблагоприятным сердечным и цереброваскулярным событиям в течение 12-месячного периода наблюдения. Наши результаты также показали, что у пациентов с ОИМ, у которых было обнаружено большое количество CD8⁺CD28⁺ Т-клеток, был увеличен размер инфаркта и ухудшена функция желудочков. Авторы предположили, что цитотоксический CD8⁺CD28⁺Т-клеточный некроз миокарда может действовать как новый и альтернативный путь развития ОИМ. На сегодняшний день до конца не исследованы Т-клеточные и гуморальные звенья иммунитета, играющие роль в возникновении острого коронарного синдрома (ОКС), в том числе у лиц, перенёсших COVID-19, что определяет актуальность проводимого исследования.

Цель исследования — оценить динамику Т- и В-клеточного звеньев иммунитета у пациентов с острым коронарным синдромом, перенёсших и не перенёсших COVID-19, в зависимости от количества CD3⁺CD8⁺T-лимфоцитов.

Материалы и методы

Обследованы 65 пациентов мужского пола с острым коронарным синдромом (ОКС) (нестабильной стенокардией и острым инфарктом миокарда (ОИМ)) в возрасте от 40 до 65 лет, которым по результатам коронароангиографии потребовалось проведение стентирования коронарных артерий. Перед обследованием все пациенты подписывали информированное согласие (протокол Этического комитета ЮУГМУ Минздрава России №9 от 11.09.2006 и протокол этического комитета ГАУЗ ОТКЗ ГКБ №1 г. Челябинска №12 от 10.10.2022).

Всем больным проводилась оценка иммунологических показателей методом проточной цитометрии [12]. В зависимости от количества CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитов (отдельно для болевших и не болевших COVID-19) выделены следующие группы: с пониженным числом CD3⁺CD8⁺ T-клеток, нормальным и повышенным. Показатели Т-клеточного и гуморального звеньев иммунитета регистрировали при поступлении в стационар и в динамике через 28 дней с момента поступления.

Общий анализ крови (25 параметров: лейкоцитарный, эритроцитарный и тромбоцитарный ростки кроветворения), количественный и качественный состав ростков кроветворения проведен стандартизованным методом на гематологическом анализаторе Medonic M20 (Швеция).

Методом проточной цитометрии гейтировали по панлейкоцитарному маркеру CD45⁺: CD3⁺ (Т-лимфоциты общие), CD3⁺CD4⁺ (хелперы индукторы), CD3⁺CD8⁺ (цитотоксические Т-лимфоциты), CD3⁺CD16⁺CD56⁺ (TNK-клетки) CD3^-CD16⁺CD56⁺ (натуральные киллеры), CD3^-CD19⁺CD5⁺ (подгруппа В-лимфоцитов), CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD127^- (Т-регуляторные клетки/супрессоры), CD3⁺CD4⁺CD25⁺ (активированные хелперы, ранняя активация лимфоцитов), CD45⁺CD3⁺HLA-DR (активированные Т-лимфоциты — поздняя активация лимфоцитов), В-клеток памяти CD27⁺, «БекманКультер», «Биолегенда» (США). Оценку иммунного статуса осуществляли методом проточной цитометрии на цитофлюориметре «Navios» (Beckman Coulter, США) по стандартизованной технологии оценки лимфоцитарного звена иммунитета [12][13].

Оценка фагоцитарной активности частиц латекса диаметром 1,7 мкм нейтрофилами (активность фагоцитоза, интенсивность фагоцитоза, фагоцитарное число), спонтанная и индуцированная НСТ-активность нейтрофилов морфологическим методом (световая микроскопия с использованием микроскопов Olimpus (Япония) [14][15][16]. Исследование проводится общепринятыми методами оценки функциональной активности фагоцитов.

Уровни общих IgA, IgG, IgM, специфические IgM, IgA, IgG, к короновирусу COVID-19, C1-ингибитора, С3а и С5а компонентов комплемента (ВекторБест, Россия, ООО «Цитокин», Россия) методом иммуноферментного анализа на иммуноферментном анализаторе Multiscan FC Thermoscientific (Китай). Исследование проводилось общепринятыми стандартизованными методами иммуноферментного анализа согласно протоколам производителей тест систем.

Обработка и анализ данных осуществлялись с помощью автоматизированной программы Statplus 2005. Так как распределение в количественных данных было нормальным, использованные статистические критерии были параметрическими [17].

Результаты

Следует отметить, что повышение CD3⁺CD8⁺T-лимфоцитов наблюдалось только у лиц, перенёсших новую коронавирусную инфекцию (COVID-19). У всех пациентов с высокими CD3⁺CD8⁺ T- клетками был ОИМ, из них у 2 — с подъёмом сегмента ST (пST) и у 2 — без подъёма ST (бп ST). У лиц с пониженными и нормальными CD3⁺CD8⁺ T- лимфоцитами, не болевшими COVID-19, преобладали больные с нестабильной стенокардией. Наибольшие баллы риска по GRACE наблюдались у пациентов с нормальными и повышенными CD3⁺CD8⁺ T-клетками, переболевших COVID-19. Продолжительность госпитализации была максимальной у больных с повышенными CD3⁺CD8⁺ T-клетками с COVID-19 в анамнезе, а минимальной — у лиц с нормальными CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитами, не болевших COVID-19. Тромбозы стентов были у 3 (12,5%) больных, перенёсших COVID-19, и нормальными CD3⁺CD8⁺ T-клетками. Наибольшее количество стентов (в среднем 2) в настоящую госпитализацию было имплантировано пациентам с повышенными CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитами. Максимальные цифры тропонина регистрировались у лиц с нормальными и повышенными CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитами, болевших COVID-19 ранее (10,61±2,57 и 8,96±6,98 нг/мл соответственно). Морфин для купирования коронарных болей чаще применялся в этих же группах: у 9 (37,5%) с нормальными CD3⁺CD8⁺ T-клетками и у 3 (75%) — с повышенными CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитами. Таким образом, наиболее клинически тяжёлыми были пациенты, перенёсшие COVID-19 и имевшие нормальные или повышенные CD3⁺CD8⁺ T-клетки.

Исходя из данных, представленных в таблице 1, можно отметить, что по возрасту между группами не было различий. Диагноз нестабильной стенокардии преобладал у лиц без COVID-19 в анамнезе, в большей степени с нормальными CD3⁺CD8⁺ T-клетками. У пациентов с повышенными CD3⁺CD8⁺ T-клетками и перенёсших COVID-19, в 100% случаев был ОИМ как с пST (50%), так и без пST (50%). Среди лиц с нормальными CD8-лимфоцитами и не болевших COVID-19, не было больных с ОИМ с пST. По количеству пациентов с ОИМ с пST лидировали лица, перенёсшие COVID-19 и имеющие нормальные или повышенные CD3⁺CD8⁺ T-клетки. В прошлом ОИМ из числа повторно обследованных пациентов перенесли в большей мере больные, не болевшие COVID-19. Больший риск по GRACE имели лица с COVID-19 ранее и повышенными, и нормальными CD8-лимфоцитами. Наибольшее количество стентов из числа обследованных дважды (исходно и в динамике) пациентов было установлено лицам со сниженными CD3⁺CD8⁺ T-клетками, перенёсших COVID-19.

У больных с ОКС, перенёсших COVID-19, были более выраженные изменения в клинико-иммунологических показателях по сравнению с таковыми, не болевшими COVID-19. В частности, была выше продолжительность госпитализации — максимальная у лиц с повышенными CD3⁺CD8⁺T-клетками, на втором месте больные с нормальными CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитами. Также коэффициент атерогенности и тропонин были больше у пациентов с ОКС, перенёсших COVID-19. Максимальный уровень тропонина отмечался у лиц с ОКС, переболевших COVID-19 и имеющих нормальный уровень CD3⁺CD8⁺ T-клеток. Тромбозы стентов и умершие были только среди пациентов, имевших в анамнезе COVID-19, в большей степени со сниженными CD3⁺CD8⁺ T-клетками, но которым определялись показатели иммунного статуса в динамике. Как отмечено в наших предыдущих работах, большая смертность и увеличение тромбозов стентов были у лиц с нормальными и повышенными CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитами, но им не всем брались иммунные показатели в динамике вследствие быстрого летального исхода. Максимальное использование морфина для купирования коронарных болей было у больных с ОКС с нормальными CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитами, переболевших COVID-19.

В таблице 1 представлена сравнительная оценка Т-лимфоцитов и гуморального звена иммунитета у лиц с ОКС.

Исходя из данных таблицы, обращает на себя внимание наименьший % Т-лимфоцитов (CD45⁺CD3⁺CD19^-) у пациентов с исходно высокими CD3⁺CD8⁺ T-клетками, болевших COVID-19, и этот показатель достоверно отличался от других групп. В то же время абсолютное число Т-лимфоцитов было минимальным в группе лиц, болевших ранее COVID-19 и имевших низкие CD3⁺CD8⁺ T-лимфоциты, и оно статическим значимо было ниже в сопоставлении с другими группами. В динамике через 28 дней количество Т-лимфоцитов значимо (р<0,0001) повысилось только у больных с исходно низкими CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитами. Также у данной категории лиц исходно регистрировалось наименьшее число Т-хелперов, в динамике произошло статистически значимое их увеличение (р<0,001), как и CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитов (р<0,0001). Достоверное повышение иммунорегуляторного индекса в динамике произошло у больных с повышенными CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитами (р<0,05). У пациентов с высокими CD3⁺CD8⁺ T-клетками исходно отмечался минимальный индекс соотношения CD4/CD8 и достоверно отличался от других групп.

Наименьшие уровни T-NK-лимфоцитов наблюдались у лиц с пониженными CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитами, как болевших, так и не болевших COVID-19, и достоверно отличались от других групп.

В динамике имелась тенденция к повышению T-NK-лимфоцитов, за исключением пациентов с высокими CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитами, у которых отмечалась склонность к снижению T-NK-клеток. Что касается натуральных киллеров, то следует отметить, что достоверное повышение этого показателя в динамике наблюдалось у больных с исходно низкими и нормальными CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитами, болевших COVID-19. Максимальное значение NK-лимфоцитов было у лиц с высокими CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитами и имело тенденцию к снижению в динамике в отличие от других групп.

Т-лимфоциты ранней активации в относительном плане достоверно (p<0,05) снизились у больных с нормальными CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитами, перенёсших COVID-19. Т-лимфоциты поздней активации были минимальными у лиц с низкими CD3⁺CD8⁺T- лимфоцитами и достоверно повысились в динамике. Максимальное число Т-лимфоцитов поздней активации отмечалось у пациентов с высокими CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитами, переболевших COVID-19. Т-регуляторные лимфоциты и Т-регуляторные клетки поздней активации значимо (p<0,01) выросли в динамике у больных с исходно низкими CD3⁺CD8⁺ T- клетками, болевших COVID-19, и достоверно снизились у пациентов без COVID-19 в анамнезе.

В таблице 2 представлены данные гуморального иммунитета исходно и в динамике у пациентов с ОКС, перенёсших и не болевших COVID-19.

Минимальное значение В-лимфоцитов (CD45⁺CD3^-CD19⁺) отмечалось у больных с низкими CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитами, болевших ранее COVID-19, статистически значимо отличавшихся от других групп, и в динамике достоверно (p<0,05) увеличилось. Наименьшее количество Jg A регистрировалось у пациентов с повышенными CD3⁺CD8⁺T-лимфоцитами. Максимальное значение Jg G отмечалось у больных с низкими CD3⁺CD8⁺T-лимфоцитами, перенёсших COVID-19, и в динамике статистически значимо (p<0,05) уменьшилось. Наиболее высокие уровни С5а фрагмента комплемента регистрировались у больных со сниженными CD3⁺CD8⁺T-лимфоцитами, болевших COVID-19, и достоверно (p<0,05) увеличилось в динамике. В-лимфоциты (CD3^-CD19⁺CD5⁺) имели наименьшие значения у лиц с пониженными цитотоксическими клетками и статистически значимо (p<0,05) выросли у больных со сниженными CD3⁺CD8⁺T-лимфоцитами, перенёсших COVID-19. Минимальный уровень В-лимфоцитов (CD3^-CD19⁺CD5^-) фиксировался у пациентов с низкими CD3⁺CD8⁺T-лимфоцитами.

Обсуждение

Несмотря на раннюю реперфузию, у пациентов с инфарктом миокарда с подъёмом сегмента ST (ИМпST) может наблюдаться обширный некроз миокарда и значительное нарушение функции желудочков. Исследование Casarotti A.C.A. et al. [18] было направлено на оценку роли подтипов B-лимфоцитов и родственных цитокинов в инфарктной массе и фракции выброса левого желудочка, полученных с помощью магнитно-резонансной томографии сердца, выполненной через 30 дней ОИМ с пST. В это проспективное исследование были включены 120 пациентов с ОИМпST, которым применяли фармакоинвазивную стратегию. Образцы крови были собраны у субъектов в первый и 30-й дни после ОИМ с пST. Количество CD3^-CD19⁺CD5⁺-лимфоцитов (клеток/мл) в 1-й день было связано с инфарктной массой, измеренной с помощью МРТ сердца на 30-й день. CD3^-CD19⁺CD5⁺-клетки были связаны с CD4⁺ Т-лимфоцитами на 1-й и 30-й дни, тогда как классические лимфоциты CD3^-CD19⁺CD5^- на 30-й день были связаны с фракцией выброса левого желудочка. После множественного линейного регрессионного анализа высокочувствительные тропонин Т и IL-6, собранные в первый день, были независимыми предикторами инфарктной массы, а на 30-й день — только уровень холестерина ЛПВП. Что касается ФВЛЖ, то высокочувствительный тропонин Т и высокочувствительный С-реактивный белок были независимыми предикторами на 1-й день, а классические лимфоциты CD3^-CD19⁺CD5^- на 30-й день. У пациентов с ИМпST, несмотря на раннюю реперфузию, количество инфарктной массы и работоспособность желудочков были связаны с воспалительными реакциями, запускаемыми циркулирующими В-лимфоцитами.

Наиболее тяжёлая клиническая группа в нашем исследовании была болевшие ранее COVID-19 с повышенным содержанием CD3⁺CD8⁺ T-лимфоцитов. Это согласуется с работой Santos-Zas I et al. [19]. После острого инфаркта миокарда у мышей CD8⁺ Т-лимфоциты рекрутируются и активируются в ишемизированной ткани сердца и высвобождают гранзим В, что приводит к апоптозу кардиомиоцитов, неблагоприятному ремоделированию желудочков и ухудшению функции миокарда. Истощение CD8⁺ Т-лимфоцитов уменьшает апоптоз в ишемизированном миокарде, препятствует воспалительной реакции, ограничивает повреждение миокарда и улучшает функцию сердца. Эти эффекты повторяются у мышей с дефицитом гранзима В CD8⁺ Т-клетках. Защитный эффект истощения CD8⁺ Т-клеток на функцию сердца подтверждён использованием модели ишемии/реперфузии у свиней. Наконец, мы показываем, что повышенные уровни гранзима В в крови у пациентов с острым инфарктом миокарда предсказывают повышенный риск смерти при 1-летнем наблюдении. Работа раскрывает вредную роль CD8 ⁺ Т-лимфоцитов после острой ишемии и предлагает потенциальные терапевтические стратегии, нацеленные на патогенные CD8 ⁺ Т-лимфоциты в условиях острого инфаркта миокарда.

Выводы

В большинстве случаев после стентирования коронарных артерий в динамике отмечались статистически значимые изменения большинства иммунологических показателей у лиц со сниженными CD3⁺CD8⁺T-лимфоцитами, болевших COVID-19: повышение T-лимфоцитов (CD45⁺CD3⁺CD19^-), Т-хелперов, CD3⁺CD8⁺T-лимфоцитов, T-NK лимфоцитов, NK-лимфоцитов, Т-лимфоцитов поздней активации, В-лимфоцитов, снижение иммуноглобулина G и C3a фрагмент комплемента.

Т-регуляторные лимфоциты и Т-регуляторные клетки поздней активации значимо (p<0,01) выросли в динамике у больных с исходно низкими CD3⁺CD8⁺T-лимфоцитами, болевших COVID-19, и достоверно снизились у пациентов без COVID-19 в анамнезе.

У лиц с нормальными CD3⁺CD8⁺T-лимфоцитами, переболевших COVID-19, в динамике наблюдалось достоверное повышение T-лимфоцитов (CD45⁺CD3⁺ CD19^-), NK-лимфоцитов, Т-лимфоцитов поздней активации, снижение относительного содержания T-лимфоцитов ранней активации.

У больных с повышенными CD3⁺CD8⁺T-лимфоцитами в динамике произошло увеличение иммуноглобулинов А и М, а также индекса соотношения CD4/CD8.