Адаптивный иммунный ответ у пациентов с атеросклерозом до и после коронарного шунтирования

Введение

Атеросклероз в настоящее время является одной из значимых проблем. Опираясь на данные Фрамингемского исследования, авторы предположили, что смертность от клинических проявлений атеросклероза к 2030 г. достигнет 22 млн в год [1]. В данном вопросе поражает то, что, несмотря на десятилетия исследований, патологические механизмы развития атеросклероза всё ещё не изучены. Мультифокальность атеросклеротического поражения различных артериальных бассейнов сопровождается разнообразием клинической симптоматики. При этом 60% приходится на долю коронарного атеросклероза, вследствие чего развивается ишемическая болезнь сердца [2]. Атеросклероз — это воспалительное заболевание, которое сопровождается миграцией иммунокомпетентных клеток в субэндотелиальную выстилку сосудов с формированием атеросклеротической бляшки. Как и в любом воспалительном ответе, при атеросклерозе наблюдается не только активация врожденного иммунитета (первой линии защиты), но и адаптивного с его антигенспецифическими свойствами [3].

В литературе встречается значительное количество публикаций, оценивающих вовлечённость адаптивного иммунного ответа у пациентов с атеросклерозом, однако работ, которые раскрывали бы изменения иммунного статуса после проведения аортокоронарного шунтирования, — единицы.

Цель исследования — оценить изменения иммунного статуса до и после проведения коронарного шунтирования.

Материалы и методы

Данное исследование было открытым, поперечным. Проводилось в ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России в 2017–2019 гг. В исследование были включены пациенты с коронарным атеросклерозом кардиохирургического отделения, лабораторная диагностика выполнялась в НИИ иЧммунологии и аллергологии ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России. Протокол исследования соответствовал принципам Хельсинской декларации ВМА и был одобрен локальным этическим комитетом. В исследовании приняли участие 70 пациентов с коронарным атеросклерозом (I группа), которым показано выполнение аортокоронарного шунтирование, согласно клиническим рекомендациям по ведению стабильной ишемической болезни сердца на основании данных прямой коронароангиографии. Коронарное шунтирование выполнялось на работающем сердце. С целью сравнительной оценки показателей адаптивного иммунного ответа обследованы 30 добровольцев (II группа), у которых нет клинических и инструментальных признаков ИБС. Обе группы составили пациенты мужского пола, сопоставимые по возрасту (57,02±1,7 и 54,9±1,3 соответственно, р=0,33). Критерием исключения для группы ИБС было наличие как активных инфекционных процессов, так и в анамнезе. Не допускались к участию в исследовании лица, имеющие сахарный диабет, ревматологические и болезни соединительной ткани, онкопатологию, пациенты, имеющие вредные привычки. Исследование показателей иммунитета проводили до операции, через 4–5, 9 –10 и 28–30 суток, что составило ранний послеоперационный период. Для определения количественного состава лимфоцитов с помощью метода проточной лазерной цитофлюориметрии проводили фенотипирование следующих популяций CD3⁺, CD3⁺CD4⁺, CD3⁺CD8⁺, CD3⁺CD25⁺, CD3⁺CD45⁺, CD3⁺CD95⁺, CD4⁺CD25⁺, CD4⁺CD154⁺. Для исследования Foxp3 и Гранзим B⁺ из периферической крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина выделяли мононуклеарные клетки, которые пермеабилизировали Intra Prep Permeabilization Reagent (Immunotech) с последующим окрашиванием моноклональными антителами к Foxp3, (eBioscience) и Гранзим В (Serotec). На проточном цитофлюориметре Cytomics FC 500 (Beckman Coulter) выполняли анализ образцов.

Исследование В-лимфоцитов (CD19⁺, CD19⁺CD40⁺) проводили с помощью проточной цитофлюориметрии (Cytomics FC 500, Beckman Coulter) с использованием соответствующих моноклональных антител. Количественное определение уровня Ig А, М, G проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле с использованием наборов моноспецифических антисывороток, содержащих антитела к тяжелым цепям соответствующих иммуноглобулинов (ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, Россия). Результаты выражали в г/л.

Для определения циркулирующих иммунных комплексов применяли метод преципитации сыворотки в полиэтиленгликоле. Учёт результатов осуществляли на спектрофотометре при длине волны 450 нм, выражали в условных единицах. Статистический анализ результатов исследования проводили с применением программы Statistica 12.0 (StatSoft, США). При этом использовали модуль описательной статистики с расчётом средней величины (М) и её ошибки (m). Различие средних величин между группами оценивали по критерию Манна-Уитни, в динамике хирургического лечения использовали критерий Вилкоксона. Оценку распределения величин и отличие от нормального распределения анализировали по критерию Шапиро Уилка. Статистическая значимость считалась достоверной при р<0,05.

Результаты

Изучение количественных показателей Т-лимфоцитов в группах ИБС выявило статистически значимое повышение относительного числа CD3⁺-лимфоцитов в группе ИБС по сравнению с группой контроля. При изучении экспрессии маркеров ранней активации (CD3⁺CD25⁺) отмечено увеличение количества активированных Т-лимфоцитов в группе ИБС, с параллельным снижением экспрессии на Т-лимфоцитах HLA DR. Содержание клеток, экспрессирующих маркер регуляции апоптоза, как и клеток, содержащих аннексин, также было значимо ниже в группе ИБС. Анализ циркулирующих в кровотоке Т-лимфоцитов памяти, экспрессирующих CD45R0⁺, выявил значительное повышение в группе ИБС по сравнению с группой контроля. В то время как пул наивных Т-лимфоцитов (CD45RА⁺) у пациентов с ИБС был ниже (табл. 1).

Анализ субпопуляционного состава Т-лимфоцитов был неоднозначным и выявил повышение относительного числа CD4⁺-лимфоцитов в группе ИБС. Не выявлено различий в содержании CD3+CD8+ лимфоцитов, и закономерным является отсутствие изменения ИРИ между группами. Количество клеток с внутриклеточным содержанием Гранзима В и CD4⁺лимфоцитов, экспрессирующих маркер ранней активации (CD25⁺), в группе ИБС было достоверно выше, как и пул CD4⁺-клеток, экспрессирующих на своей поверхности CD154⁺ (СD40L), необходимый для взаимодействия с В- клетками, но количество иммунорегуляторных лимфоцитов CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ характеризовалось значительным снижением (табл. 2).

В гуморальном звене адаптивного иммунного ответа в группе ИБС отмечается увеличение пула CD19+ лимфоцитов и количества циркулирующих В-клеток, несущих корецептор межклеточного взаимодействия CD40, а также усиление продукции основных классов иммуноглобулинов (А, М, G) (табл. 3).

Сопоставляя показатели иммунного ответа в обеих группах, мы отметили следующие различия между ними. Так, у пациентов группы ИБС наблюдается разобщение процессов активации Т-лимфоцитов, их созревания и апоптоза, супрессия иммунорегуляции и активация межклеточной кооперации.

Известно, что АКШ является «золотым стандартом» лечения ИБС, но, как и любое хирургическое вмешательство, оказывает влияние на все системы, поддерживающие гомеостаз, в том числе и иммунную. Учитывая, что иммунная система играет решающую роль на всех этапах атерогенеза, целесообразным является детальное изучение механизмов иммунного реагирования при проведении АКШ у пациентов с ИБС и сопоставление их с группами в зависимости от наличия неблагоприятных повторных событий.

Динамика показателей клеточного и гуморального звеньев адаптивного иммунного ответа

Анализ параметров Т-лимфоцитов пациентов в течение месяца после АКШ выявил незначительное колебание в содержании CD3⁺-лимфоцитов, а также клеток, экспрессирующих маркер ранней (CD3⁺CD25⁺) и поздней (CD3⁺HLA DR⁺) активации. Однако эти колебания статистически не значимы. Интересной представляется характеристика лимфоцитов, экспрессирующих регуляторный маркер апоптоза CD95: относительное количество CD3⁺CD95⁺-клеток, а также абсолютные значения достоверно снижались к 4–5-м суткам и через 12 дней после операции, с возвратом к исходным значениям через месяц после вмешательства. Аналогичным образом изменялось количество клеток, окрашиваемых аннексином. Не отмечено значимой динамики, в содержании Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD45RO⁺, в то время как количество CD45RА⁺ наивных Т-лимфоцитов статистически значимо уменьшалось в аналогичный период и через 12 суток после операции с восстановлением до исходных значений через месяц (табл. 4).

Изучение динамики субпопуляционного состава Т-лимфоцитов у пациентов в течение месяца после АКШ не выявило значимого изменения CD3⁺CD4⁺-лимфоцитов. При этом содержание CD3⁺CD8⁺-цитотоксических лимфоцитов статистически достоверно было снижено к 4–5-м суткам и через 10–12 суток после операции. Указанные изменения привели к значимому увеличению ИРИ, соответственно, к 4–5-м и 12–м суткам после вмешательства. Функциональная активность CD8⁺-лимфоцитов, выраженная в содержании Гранзима В (CD8⁺Gr⁺), имела лишь тенденцию к снижению на 4–5-е сутки и 12-е сутки после операции. В содержании пула CD3⁺CD4⁺-клеток, имеющих маркер ранней активации (CD25⁺), в количестве CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ лимфоцитов, клеток экспрессирующих CD154⁺ (СD 40L), в течение месяца наблюдения, изменений не отмечено (табл. 5).

В гуморальном звене адаптивного иммунного ответа наблюдалось повышение содержания В-клеток, начиная с 12-х суток и через месяц после вмешательства. Отмечалось увеличение пула В-лимфоцитов, несущих корецептор межклеточного взаимодействия CD40, начиная с 4–5-х суток и сохранялось значимо повышенным через 1 месяц наблюдения. Следует отметить, что функциональная активность В-клеток в виде продукции иммуноглобулинов классов A, M и G не претерпела значимых изменений в течение месяца наблюдения. Существенная динамика отмечена лишь в содержании ЦИК увеличением их уровня на 4–5-е сутки после операции с постепенным снижением к концу месяца наблюдения (табл. 6).

Таким образом, результаты иммунологического мониторинга в динамике после АКШ отличаются разнонаправленными характеристиками в различные сроки наблюдения и демонстрируют различную степень вовлечённости адаптивных механизмов иммунной защиты.

Обсуждение

Отличительной особенностью пациентов с ИБС в нашем исследовании является снижение в периферическом кровотоке пула наивных Т-лимфоцитов, которые при взаимодействии с АПК дифференцируются в Т-хелперные субпопуляции различного порядка. Следует подчеркнуть, что у больных ИБС в нашей работе, наряду со снижением количества циркулирующих наивных Т-клеток, отмечено повышение по сравнению с данными контрольной группы доли субпопуляции CD4+CD45R0+ Т-лимфоцитов памяти. Полученные результаты согласуются с мнением авторов, показавших взаимосвязь уровня Т-лимфоцитов памяти и тяжестью коронарного атеросклероза, продемонстрировавшие наибольшее содержание CD4+CD45R0+ у пациентов с острыми формами ИБС [4,5].

Неоднозначные результаты, отражающие дисрегуляторные процессы иммуногенеза, получены при характеристике активационных ресурсов Т-лимфоцитов. Так, отмечается повышение количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих ранний активационный маркер CD25+, и снижение Т-лимфоцитов, экспрессирующих поздний активационные маркер HLA DR+. Результаты, полученные в нашей работе, согласуются с выводами Гольдеровой А.С. и соавт. (2011), отметившими повышение количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD25, у пациентов с мультифокальным коронарным атеросклерозом и отсутствие изменений в группе с однососудистым поражением коронарного русла [6].

Повышение экспрессии данного маркера свидетельствует о возможности активной реализации эффекторных механизмов клеточными субпопуляциями Тхелперов, что подтверждается в наших результатах повышением экспрессии рецептора к ИЛ-2 (CD25) на CD4+ Т-клетках. Наши данные не противоречат результатам других авторов, показавших повышении экспрессии данного маркера у пациентов с более тяжёлыми формами ИБС (острый коронарный синдром и нестабильная стенокардия) и ассоциацию с повышением в сыворотке крови ИЛ-6 и ИФН-γ [7][8]. Снижение количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих поздний активационный маркер HLA DR, возможно, объясняется тем, что на разных стадиях атеросклероза CD3+HLADR+лимфоциты обнаруживаются при морфологических исследованиях в атероме, но не в периферическом кровотоке [9]. В литературе встречаются работы, показавшие снижение экспрессии HLA DR на лимфоцитах в периферическом кровотоке у пациентов со стабильными формами ИБС и повышение её при инфаркте миокарда и нестабильной стенокардии [8][10]

В полученных нами результатах, несмотря на повышение количества CD4+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих ранний активационный маркер CD 25+, отмечено снижение клеток фенотипа CD4+CD25+Foxp3+, выполняющих иммунорегуляторную роль. Снижение периферического пула данных лимфоцитов является одним из факторов, обеспечивающих развитие аутоиммунной агрессии [11]. Оно ассоциировано с более выраженным коронарным атеросклерозом [12]. Свой супрессорный потенциал Трег клетки осуществляют путем синтеза противовспалительных цитокинов ИЛ-10, ИЛ-35 и ТФР-1β [5]. Более того, выявлено, что окисленные ЛПНП ингибируют экспрессию регуляторной субъединицы Foxp3 в CD4+CD25+-лимфоцитах, что приводит к утрате их иммунорегуляторной функции [13]. Отмечается также снижение иммуносупрессивной активности CD4+CD25+Foxp3+ на фоне повышения концентрации ФНО-α в сыворотке крови у пациентов с атеросклерозом [14]. Следует подчеркнуть, что аналогичная закономерность нашла отражение в нашей работе и согласуется с данными авторов, которые отметили снижение CD4+CD25+Foxp3+ клеток у пациентов с острым коронарным синдромом без подъёма сегмента ST [15] и стенокардией напряжения [16]. Восприятие активационных стимулов Т-лимфоцитами обеспечивает дальнейшие пути иммунопатогенеза ИБС с реализацией их в пролиферацию либо апоптоз. У пациентов с ИБС, обусловленной атеросклерозом, нами выявлена дискоординация этих процессов в сопоставлении с данными контрольной группы. Так, отмечено существенное снижение популяции CD3+ -лимфоцитов, экспрессирующих маркер готовности к апоптозу (CD95+) и CD3+клеток, содержащих аннексин, то есть вступивших в процесс программированной гибели [6]. Данное предположение отражено в работе Pasqui A.L. и соавт. (2003), которые показали эту взаимосвязь у пациентов с инфарктом миокарда и отсутствие её у пациентов со стабильной стенокардией [8]. Наличие дисбаланса в процессах апоптоза/пролиферации в сторону угнетения апоптоза, соответственно, усиления пролиферативной активности Т-лимфоцитов, поддерживает прогрессирующее воспаление у пациентов с атеросклерозом и может быть проявлением аутоиммунного ответа, в том числе на эндогенные антигены [17][18].

Повышение экспрессии CD154 на CD4+ лимфоцитах, а также CD40 на В-лимфоцитах, отмеченные в нашем исследовании, указывают на усиление процессов Т-В взаимодействия, приводящее к активации последних. Присутствие корецепторной молекулы на Т-лимфоцитах и рецептора на В-лимфоцитах превращает популяцию В-клеток в плазматические, активно синтезирующие иммуноглобулины различных классов, но в большей мере Ig G, в то время как при отсутствии такого взаимодействия продуцируются в основном Ig класса М. Кроме того, данное корецепторное взаимодействие способствует активации и цитотоксических Т-лимфоцитов, усиливая их эффекторный потенциал [19]. Представленное утверждение согласуется с результатами нашего исследования, которое демонстрирует повышение не только абсолютного числа CD8+-лимфоцитов, но и их цитолитической активности, опосредованной содержанием внутриклеточного Гранзима В [20].

Анализ свойств CD3+-лимфоцитов показал, что в группе ИБС после проведения АКШ регистрируется ещё большее угнетение процессов апоптоза и снижение количества клеток с внутриклеточным содержанием аннексина и наивных Т-лимфоцитов, которые возможно связаны с применением глюкокортикостероидов в раннем послеоперационном периоде и хирургическим стрессом. Количество Трег. лимфоцитов, волнообразно, незначимо меняясь в течение раннего послеоперационного периода, возможно, служит отражением снижения провоспалительной направленности иммунного ответа, о чём свидетельствуют и снижение пула цитотоксических Т-лимфоцитов, и повышение ИРИ.  Известно, что CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺-лимфоциты контролируют процессы пролиферации/апоптоза, а снижение количества Трег. сопряжено с дисрегуляцией данного соотношения [11]. Подобное утверждение демонстрируется снижением относительно контрольных значений как числа CD3⁺СD95⁺-клеток, так и Т-лимфоцитов, вошедших в процесс программированной гибели.

Т-лимфоциты, экспрессирующие СD154 в течение раннего послеоперационного периода, значимо не меняются, сохраняясь на исходно повышенном уровне и наряду с увеличением содержания В-лимфоцитов и количества В-клеток, экспрессирующих CD40. Эти изменения, возможно, обусловлены сохраняющимся повышенным аутоиммунным ответом на окисленные ЛПНП.

Заключение

Таким образом, у пациентов с коронарным атеросклерозом наблюдается дискоординация процессов активации Т-лимфоцитов, их созревания и апоптоза, cупрессия иммунорегуляции и активация межклеточной кооперации. В динамике после АКШ показатели иммунитета отличаются разнонаправленными характеристиками в различные сроки наблюдения и демонстрируют разную степень вовлечённости адаптивных механизмов иммунной защиты.