Биомаркеры анафилаксии

Введение

В соответствии с существующими на сегодня международными и отечественными согласительными документами анафилаксия (АФ) представляет собой тяжёлую, угрожающую жизни, генерализованную или системную реакцию гиперчувствительности, которая развивается быстро и может привести к смерти [1][2][3]. Диагноз АФ продолжает оставаться в первую очередь клиническим и верифицируется в случае соответствия симптомов системной реакции одному или более клиническим критериям АФ [1][2][3]. Ежегодно инициируется значительное количество исследовательских работ, направленных на более глубокое изучение механизмов развития АФ и поиск её биомаркеров, которые могли бы с высокой долей вероятности не только подтвердить диагноз анафилактический реакции, но и эффективно использоваться в качестве предикторов риска ее развития, тяжёлого течения и летального исхода [4][5][6][7]. Термин «биомаркер» имеет различные дефиниции, наиболее часто под ним понимают количественные характеристики физикальных данных и/или лабораторных показателей, для которых определены границы «нормы» и «патологии» [8]. Оптимальный биомаркер должен быть высокоспецифичным, чувствительным, прогностическим, быстрым и простым в использовании, приемлемым по стоимости и минимально неинвазивным. В качестве биомаркеров АФ в настоящее время можно выделить специфические иммуноглобулины класса Е (sIgE), играющие ключевую роль в развитии иммунной IgE-опосредованной АФ, а также ряд потенциальных неспецифических биомаркеров — медиаторов АФ, синтезируемых и высвобождаемых различными популяциями эффекторных клеток, задействованных в патогенезе иммунных и неиммунных системных реакций.

Специфические иммуноглобулины класса Е

В основе механизма развития IgE-опосредованной АФ лежит типичная аллергическая реакция немедленного типа, обусловленная взаимодействием sIgE-антител с релевантными аллергенам. Определение sIgE в сыворотке крови пациентов с подозрением на АФ является важным и неотъемлемым этапом аллергообследования с целью выявления возможной клинически значимой сенсибилизации и идентификации триггера системной реакции. Определение sIgE проводится к селективным источникам (например, коровье молоко, куриное яйцо и т.д.) и/или выбранным молекулам аллергенов (предпочтительно рекомбинантным) с использованием тест-системы ImmunoCap, а также в ряде случаев к обширной панели аллергенных молекул (аллергочип Immuno Solid-phase Allergy Chip (ISAC). Именно эти диагностические системы применяются в подавляющем большинстве как клинических, так и экспериментальных исследований посвященных АФ, что определяется их исключительно высокой чувствительностью и специфичностью, а также воспроизводимостью. Как правило, оценка sIgE проводится не ранее, чем через 4–6 недель после перенесённого эпизода системной реакции. Перечисленные тесты наиболее информативны в рамках диагностики пищевой АФ, они также активно используются при лекарственной, инсектной и других видах АФ [4][9][10]. По данным наших работ, практически у всех пациентов с пищевой АФ выявлялись уровни sIgE выше пороговых значений (≥0,35 kU/L) к предположительному пищевому триггеру, концентрация данного биомаркера значительно варьировали, однако не коррелировали с тяжестью реакций [11][12]. Вместе с тем высокая степень сенсибилизации (>100 kU/L) к рыбе/морепродуктам была связана с ингаляционной гиперчувствительностью к данному аллергену и определяла особенности элиминационных мероприятий (исключение нахождения в помещении, где жарят, варят, разделывают рыбу/морепродукты) для профилактики повторных эпизодов АФ у этой группы пациентов [12][13]. В случае идиопатической АФ определение sIgE с использованием платформы ISAC является эффективным инструментом для выявления таких скрытых триггеров, как альфа-Gal, омега-5-глиадин пшеницы, белок-неспецифический переносчик липидов, олеозин (семян кунжута, миндаля, арахиса, фундука), сенсибилизации к аллергенам нематоды семейства Anisakidae [14][15]. По данным Heaps A. et. al, у 20% больных с идиопатической АФ удавалось идентифицировать причинно-значимые триггеры с использованием аллергочипа ISAC [16]. Кроме того, важная роль определения уровня sIgE к «опасным» мажорным молекулам ряда пищевых аллергенов заключается в его эффективном использовании в формировании групп пациентов высокого риска по развитию системных (в том числе перекрестных) реакций, контроля динамики нарастания сенсибилизации или, напротив, развития толерантности. В частности, предиктивным маркером развития тяжёлых, в том числе и системных, реакций к молоку является высокая или нарастающая в динамике сенсибилизация к казеину (Bos d 8) [17], куриному яйцу — сенсибилизация к овомукоиду (Gal d1) [18], арахису — чувствительность к его рекомбинантным аллергенам (Аra h1, Аra h2, Аra h3, Аra h6, Аra h9) [19] и т. д. В свою очередь при значимом снижении в динамике уровня sIgE к причинно-значимому пищевому аллергену и конкретным его компонентам с учётом отсутствия за последние несколько лет эпизодов АФ, а также комплекса других клинических симптомов в ряде случаев возможно рассмотрение введения продукта путём проведения провокационной пробы в условиях стационара.

Таким образом, sIgE, несомненно, являются ключевыми биомаркерами IgE-опосредованной АФ, которые в настоящее время активно используются в клинической практике не только для дифференциальной диагностики и выявления триггера системных реакций, но и для определения в целом риска развития АФ, в том числе ингаляционной гиперчувствительности к ряду различных аллергенов, а также прогноза развития толерантности и возможности введения причинно-значимого пищевого продукта. Вместе с тем, в настоящее время существует множество открытых вопросов о связи наличия IgE-опосредованной сенсибилизации и АФ. Так, неясно, почему АФ возникает только у части людей с выявленной сенсибилизацией к определённому аллергену, чем определяется отсутствие тесной корреляция концентрации sIgE и тяжести системной реакции и т. д. Безусловно, эти и другие клинически значимые факты свидетельствуют о роли не только sIgE, но и других факторов в развитии АФ.

Неспецифические биомаркеры анафилаксии

Неспецифические маркеры АФ высвобождаются задействованными эффекторными клетками (тучными клетками, базофилами, макрофагами, нейтрофилами и др.) непосредственно в острый период системной реакций (табл. 1). Данные медиаторы имеют различные характеристики в отношении их клинической значимости (улучшение диагностики, стратификации тяжести и риска развития АФ, ответа на терапию), периода полувыведения из организма, особенностей сбора биоматериала для проведения анализа и последующей интерпретации результатов, что существенно влияет на возможность их применения в реальной клинической практике.

Триптаза является нейтральной сериновой протеазой, содержащейся в секреторных гранулах тучных клеток. Триптаза продуцируется преимущественно тучными клетками, поэтому уровень данного фермента в плазме является ключевым биомаркером, отражающим их активацию, в том числе в острый период АФ, базофилы также могут высвобождать триптазу, но в значительно меньших количествах. Выделяют две основные изоформы триптазы (α и β), первая (α-триптаза) высвобождается постоянно, её концентрация в организме достаточно стабильна, и повышается она при увеличении количества тучных клеток, в частности при мастоцитозе, а в случае активации (дегрануляции) тучных клеток при АФ высвобождается β-триптаза [6]. Содержание триптазы в тучных клетках различных органов варьируется, что может определять зависимость тяжести острой реакции от пути попадания аллергена в организм. На сегодня доступны диагностические коммерческие тесты для определения общей триптазы (α/β-триптаз), что позволяет оценивать данный биомаркер в клинической практике. Метод измерения сывороточной триптазы стабилен, надёжен и прост в обработке, но существуют ограничения для сроков взятия биоматериала. Базальный уровень триптазы у здоровых людей в сыворотке крови составляет от 1 до 11 нг/мл (ImmunoCap).

С первых минут развития симптомов АФ, концентрация триптазы в сыворотке крови резко увеличивается, далее её нарастание достигает пиковых значений в течение 60–90 мин., за чем следует её неуклонное снижение с последующим исчезновением в течение нескольких часов [5]. При подозрении на АФ в соответствии с рекомендациями согласительных документов образцы крови для определения триптазы необходимо собирать два раза: первый — во временном интервале от 15 минут до 3-х часов после возникновения первых симптомов АФ, второй — через 24 часа и более после исчезновения симптомов АФ для определения базального уровня маркера [1][2]. Измерение базального уровня триптазы вне острого эпизода АФ особенно актуально для пациентов, у которых в острый период системной реакции концентрация триптазы фиксируется в переделах референсных значений и если она оказывается выше значений, полученных по формуле [ 1,2 x базисный уровень + 2 нг/мл], то может рассматриваться диагностически значимой для АФ [1][2].

На основании результатов проведённых исследовательских работ клиническая значимость определения уровня триптазы как биомаркера АФ рассматривается в контексте диагностики, риска развития, стратификации тяжести АФ и зависит от ряда факторов (триггера, возраста пациентов, симптомов). Повышение концентрации триптазы наиболее часто наблюдается при инсектной и лекарственной видах АФ, при этом в случае пищевой АФ рассматриваемый биомаркер менее потенциален и нередко определяется в пределах нормы, даже если взятие крови проведено в оптимальное время. Так, при развитии периоперационной АФ у детей высокая концентрация триптазы крови отмечается более, чем у половины пациентов [20][21], в случае лекарственной АФ — может отмечаться более значительное и затянувшееся повышение уровня данного маркера [22]. По данным Ruëff F. et. al, у пациентов с инсектной аллергией высокая концентрация базального уровня триптазы повышает риск развития АФ при проведении аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ) [23]. Показано, что уровни триптазы сыворотки крови положительно коррелируют с концентрацией гистамина, тяжестью АФ, развитием выраженной гипотензией и кожными симптомами (эритемой и крапивницей) [22][24]. У некоторых пациентов отсутствие повышения уровня триптазы в острый период АФ, но одновременно повышение гистамина могут свидетельствовать о преимущественном задействовании базофилов в развитии системной реакции [25]. При интерпретации результатов уровня триптазы важно учитывать, что её нормальная или незначительно повышенная концентрация может наблюдаться у 36–40% пациентов в острый период АФ, что не исключает данного диагноза [24][26]. У детей раннего возраста базальный уровень триптазы исходно повышен и лишь к 9–12 месяцам он достигает уровня нормальных значений [27], у взрослых пациентов концентрация триптазы имеет тенденцию увеличиваться с возрастом, [28] и, по некоторым данным, её уровень у мужчин выше, чем у женщин [29]. Кроме того, триптаза может повышаться у больных с острой аллергической реакцией, протекающей в виде изолированных кожных симптомов, при системном мастоцитозе, онкологических заболеваниях и ряде других состояний, не относящихся к АФ [22].

В целом, триптза на сегодня является признанным патогенетически значимым, доступным и рекомендованным для измерения в рутинной практике биомаркером АФ, который имеет определённую доказательную базу, однако существующие ограничения чувствительности маркера и периода забора крови значительно ограничивают и усложняют его использование.

Гистамин является следующим важным медиатором IgE-опосредованных аллергических реакций, источником которого служат гранулы тучных клеток и базофилов. Действие гистамина определяет развитие большинства симптомов АФ (отёк, гиперемия, крапивница, зуд и др.) и коррелирует с её тяжестью [24], но информативность определения концентрации гистамина в плазме и/или его метаболитов (N-метилгистамина и N-метилимидазол ацетат) в моче как биомаркеров АФ до настоящего времени остаётся сомнительной. При развитии АФ уровень гистамина в плазме крови достигает своего пика через 5 минут после воздействия аллергена и возвращается к базальным значениям уже через 15–30 минут [30]. В связи с этим использование гистамина как неспецифического маркера АФ возможно лишь при сборе образцов крови в течение первых 15 минут от начала реакции, что в условиях реальной практики крайне затруднительно. Быстрое снижение концентрации гистамина в плазме связано с его последовательным метилированием N-метилтрансферазой с образованием N-метилгистамина и дальнейшим его окислительным деаминированием под действием диаминоксидазы в N-метилимидазол ацетат. Образовавшиеся метаболиты стабильны и могут обнаруживаться в моче в течение 24 часов и более от начала развития симптомов АФ и, по некоторым данным, коррелируют с её тяжестью [26]. В настоящее время имеются коммерческие наборы для данного исследования, однако их использование в клинической практике непопулярно, кроме того, нормальный уровень данных маркеров не исключает диагноза АФ, ложноположительные результаты теста могут быть связаны с предварительным употреблении в пищу продуктов-гистаминолибераторов, с системным мастоцитозом [31].

Химаза относится к группе сравнительно новых и ещё малоизученных биомаркеров АФ. Химаза является сериновой протеазой, которая обнаруживается в секреторных гранулах тучных клеток. Данный маркер достаточно стабилен в сыворотке крови, он обнаруживался в восьми случаях фатальной АФ на аутопсии, его концентрация положительно коррелировала с уровнем триптазы сыворотки крови [32]. В аналогичной работе Osawa M. et. al идентифицировали химазу в тучных клетках лёгких при аутопсии 3-х случаев фатальной АФ наряду с отсутствием данного маркера в клетках контрольной аутопсии без АФ [33]. Уровень химазы в сыворотке крови пациентов с пищевой, лекарственной и инсектной АФ определялся выше относительно показателей её концентрации в образцах крови контрольной группы в течение 8 часов от момента развития первых симптомов АФ, и она продолжала оставаться высокой не менее 24 часов [34].

Наряду с перечисленными маркерами карбоксипептидаза A3 является ещё одним потенциальным медиатором АФ, высвобождаемым активированными тучными клетками. Brown T. A. et. al в своей работе анализировали уровни карбоксипептидазы A3 в крови и слюне 33-х пациентов с подозрением на лекарственную аллергию, проходящих провокационные тесты [35]. Исходно базальные уровни карбоксипептидазы А3 были выше в сыворотке крови и слюне пациентов с положительными провокационными пробами и у пациентов, которые имели в анамнезе тяжелые аллергические реакции с сердечно-сосудистыми и/или респираторными симптомами. При анализе данного маркера непосредственно в момент провокации его уровень повышался только в слюне пациентов с положительной пробой. В свою очередь, по данным Zhou X. et. al, в образцах плазмы/сыворотки крови пациентов, собранных в течение восьми часов после начала системной аллергической реакции, также определись высокие уровни карбоксипептидазы А3, которые в 70% случаев характеризовались нормальной концентрацией триптазы [36]. В целом, стабильность карбоксипептидазы А3, широкий временной диапазон для её определения, перспективность её использования у пациентов с нормальным уровнем триптазы и неинвазивность метода определения карбоксипептидазы А3 в слюне, оправдывают дальнейшие исследования в отношении значимости данного маркеров в рамках АФ.

В дополнение к медиаторам тучных клеток имеются многообещающие данные относительно главного фактора хемотаксиса базофилов — CCL2, ответственного за обеспечение притока базофилов к очагу воспаления после воздействия аллергена. Потенциальное использование CCL-2 в качестве биомаркера АФ было изучено в работе Korosec P. et. al, где он оценивался в образцах крови, взятых непосредственно во время эпизода АФ, через 7 и 30 дней после перенесенной системной реакции [37]. В ходе исследования показано, что абсолютное количество циркулирующих базофилов было значительно ниже в острый период АФ относительно периода вне реакции. Концентрация CCL-2, напротив, была значительно выше в острый период АФ в сравнении с образцами, взятыми вне реакции, при этом уровень CCL-2 снижался до исходных значений в течение 2-х часов после появления симптомов АФ. Чувствительность и специфичность теста оценивалась как 94% и 96% соответственно. Результаты аналогичного исследования продемонстрировали не только повышение CCL-2 в сыворотке крови в острый период системных реакций, но и выраженную положительную корреляцию данного маркера с их тяжестью [38].

По данным ряда исследований, одну из ключевых функций в патогенезе АФ играют фактор активации тромбоцитов (PAF) и расщепляющий его фермент ацетилгидролаза фактора активации тромбоцитов (PAF-AG). PAF является провоспалительным фосфолипидом, который синтезируется и секретируется тучными клетками, моноцитами и тканевыми макрофагами. Эффекты PAF при АФ в значительной степени определяют симптомы со стороны сердечно-сосудистой системы (гиповолемию, повышение сосудистой проницаемости, нарушения функции миокарда и др.). По данным серии исследовательских работ, в момент анафилактического приступа в сыворотке крови пациентов определяются высокий уровень PAF и низкий уровень PAF-AG, которые коррелируют с тяжестью АФ [39][40][41] в большей степени, чем триптаза и гистамин. При анализе базального уровня PAF-AG у пациентов с инсектной АФ (вне острой реакции) были продемонстрированы схожие результаты. Одним из важных недостатков PAF является крайне короткий период жизни (3–15 минут) с момента развития симптомов АФ, что делает практически невозможным применение данного маркера в клинической практике.

На сегодняшний день имеются сообщения, демонстрирующие защитную роль ангиотензинпревращающего фермента (ACE) в отношении развития жизнеугрожающих отеков при АФ [42][43]. Summers C. et. al отмечают, что у пациентов, имеющих в анамнезе выраженный отек глотки и гортани при развитии острых аллергических реакций на пищевые аллергены, базальные уровни ACE в сыворотке крови значительно снижены по сравнению с пациентами без подобных симптомов в анамнезе [44]. Cнижение концентрации ACE в сыворотке крови в десятки раз повышало относительный риск развития тяжёлого, жизнеугрожающего отёка глотки и гортани у этих больных.

Среди менее изученных маркеров острого периода АФ, можно выделить дипептидилпептидазу 1 (DPP1), концентрация которой в сыворотке крови при АФ положительно коррелирует с уровнем химазы и предположительно ее активирует [34][45]. В качестве альтернативы гистамину как сывороточному маркеру АФ активно изучается роль функционально схожего белка гранул базофилов базагранулина [46]. В патогенезе анафилактической реакции задействуются различные процессы высвобождения гепарина, что приводит к активации системы комплимента и фактора XII, определяет протеолиз кининогена и высвобождение брадикинина, при этом степень активации системы комплимента и уровень брадикинина коррелируют с тяжестью АФ [26][47]. Кроме того, есть данные, указывающие на потенциальную значимость в рамках АФ определения в моче концентрации лейкотриена Е4 (LTE4) и 11-бета-простагландин F2-альфа [48]. Уровень ряда других воспалительных медиаторов в плазме крови, таких как IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, интерферон-гамма (IFN-γ), фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), может быть повышен у пациентов при АФ и коррелировать с её тяжестью, но чувствительность и специфичность этих маркеров до настоящего времени не установлена [24].

Существенными недостатками большинства вышеперечисленных неспецифических биомаркеров острого эпизода АФ являются их условная стабильность и ограниченный временной период для сбора образцов биоматериала, что вносит определённые сложности для их применения и интерпретации. В этой связи активно изучаются и идентифицируются потенциальные генетические биомаркеры АФ, которые обладают хорошей стабильностью, не имеют ограничений по времени, могут измеряться вне острого периода АФ и, следовательно, потенциально актуальны для профилактики системных реакций и формировании групп пациентов, имеющих высокий риск тяжёлого течения АФ. В частности, мутации гена С-KIT, регулирующего функцию тучных клеток, были связаны не только с мастоцитозом, но и со случаями идиопатической АФ [49]. Górska A. et. al выявили связь повышения экспрессии гена фактора 4, ассоциированного с рецептором фактора некроза опухоли (TRAF-4), с развитием пищевой АФ у пациентов с мастоцитозом [50]. В некоторых работах продемонстрирована связь АФ с изменениями функционирования генов, кодирующих интерлейкины, которые оказывают решающее значение в регуляции баланса Th1/Th2 клеточного ответа. Так, были выявлены однонуклеотидные полиморфизмы генов, кодирующих IL4 и IL-10 у пациентов с АФ к пенициллину [51][52]. По данным наших исследований, у детей с пищевой АФ (вне острого эпизода) определялось достоверное снижение экспрессии гена ацетилгидролазы фактора активации тромбоцитов (PLA2G7) в сравнении с группой контроля без АФ [53]. Кроме того, была выявлена отрицательная корреляция, между степенью тяжести АФ и экспрессией исследуемого гена, а также установлена взаимосвязь в виде значимого снижения его экспрессии у пациентов, имеющих в анамнезе клинические симптомы со стороны сердечно-сосудистой системы (падение артериального давления, выраженная тахикардия/брадикардия) при развитии АФ. В ходе озвученной работы были получены интересные данные в отношении экспрессии гена ангиотензинпревращающего фермента (ACE) [53]. Частота определения экспрессии данного гена у пациентов, имеющих в анамнезе при развитии АФ лёгкие и локализованные отёки или без таковых, оказалась достоверно выше в сравнении с пациентами с АФ сопровождающейся жизнеугрожающими отёками языка и мягких тканей ротоглотки.

Заключение

Результаты многочисленных работ очевидно подтверждают тот факт, что спектр иммунных клеток и медиаторов, вовлечённых в патогенез анафилактических реакций, является крайне сложным и разнообразным. Поиск и внедрение в клиническую практику потенциальных биомаркеров АФ, несомненно, является важным инструментом для облегчения верификации диагноза, профилактики и оценки риска повторных эпизодов АФ, стратификации тяжести её течения, риска развития жизнеугрожающих/летальных эпизодов системных реакций и может иметь ключевое значение в разработке новых терапевтических стратегий.