Роль врожденного иммунитета в формировании различных вариантов течения сезонного аллергического ринита

Введение

Сезонный аллергический ринит (САР) правомерно отнесен к лидерам аллергопатологии с позиции распространенности [1][2]. Именно для контроля за САР весьма интенсивно развиваются технологии топической идентификации причинно-значимых аллергенов, совершенствуются подходы лечения и профилактики. Успех в решении этих задач может базироваться только на знаниях механизмов иммунопатогенеза заболевания [3–5]. Участие специфических иммунных реакций по Th2-варианту при формировании атопии не вызывает сомнений [6][7]. Между тем накапливается все больше данных о вовлечении в иммунопатогенез аллергических заболеваний, в том числе САР, антигеннезависимых иммунных процессов [8][9]. В настоящее время ни у кого не вызывает сомнений постулат о значимости врожденного иммунитета в реализации специфических иммунных процессов, как и об эффектах адаптивных реакций на потенциал врожденного иммунного ответа. Известно, что врожденный ответ на протеазы аллергенов, в том числе пыльцы, может индуцировать цитокины эпителиального происхождения IL-33, IL -25, стромальный лимфопоэтин тимуса (TSLP), которые приводят к активации лимфоцитов системы врожденного иммунитета ILC 2 для высвобождения цитокинов 2 типа антиген-независимым образом [10]. Условия, связанные с активацией тучных клеток и ILC2 создают направленность дифференцировки клеток макрофагального ряда в М2-фенотип и обеспечивают их участие в поддержании воспаления и клинической манифестации САР [11][12]. Патобиологическая роль перечисленных факторов врожденного иммунного ответа в поддержании местного аллергического воспаления активно изучается [13]. Между тем, данные об изменениях в системном иммуногенезе, формирующихся в ответ на прогрессию местного воспаления 2 типа, мало изучены и достаточно дискуссионны. В то же время динамика этих процессов может быть значима в выборе сценария клинической манифестации, прогнозе течения САР.

Цель исследования — изучение динамики параметров врожденного иммунного ответа у больных с различными вариантами течения сезонного аллергического ринита.

Материалы и методы

Сравнительное проспективное эмпирическое исследование по оценке показателей иммунной системы в зависимости от тяжести клинического течения САР проведено на кафедре клинической иммунологии и аллергологии на базе кабинета аллерголога-иммунолога консультативно-диагностического отделения и лаборатории клинической иммунологии и аллергологии РостГМУ. В исследовании участвовали пациенты с сезонным аллергическим ринитом, разделенные на подгруппы с легким (34 человека) и среднетяжелым (28 человек) вариантами течения, как мужчины, так и женщины в возрасте от 18 до 50 лет. 

Проведение исследования состояло из двух контрольных точек. Первичное обследование в период выраженной клинической манифестации, в сезон пыления причинно-значимого аллергена, при обращении в консультативную поликлинику, до назначения терапии. Повторное обследование в период ремиссии длительностью не менее двух месяцев вне сезона палинации. Исследование проходило с июля 2017 г. по март 2019 г.

Критериями включения служили возраст, подтвержденный диагноз САР легкой или среднетяжелой степени течения со стажем заболевания не менее двух лет, доказанной сенсибилизацией к пыльцевым аллергенам, без применения метода АСИТ для контроля болезни. Из исследования исключались беременные, кормящие, пациенты с коморбидной соматической патологией в стадии субкомпенсации или декомпенсации, с впервые выявленным диагнозом САР, при наличии признаков острой инфекционной патологии. Все пациенты подписывали информированное согласие на участие в исследовании в соответствии с протоколом, одобренным Локальным Независимым Этическим Комитетом ФГБОУ ВО РостГМУ (протокол № 18/13 от 12.12.13). Диагноз САР пациентам был поставлен в соответствии с Федеральными клиническими рекомендациями по диагностике и лечению аллергического ринита [14].

Оценивали анамнестические данные, результаты клинического осмотра и выраженности в период обострения основных симптомов САР: заложенность носа, ринорея, зуд в носу, чиханье. Для объективизации результатов клинического осмотра использовали шкалу общей тяжести симптомов ринита Totаl nasal symptom score (ТNSS) [15], стандартизированный опросник качества жизни больных аллергическим ринитом Rhinitis Quality of Life Questionnaire (RQLQ) [16].

Методы исследования в сезон пыления и клинической манифестации САР состояли в проведении и оценке данных микроскопии слизи полости носа. Микроскопия производилась после окраски мазка по методу Романовского–Гимзы для характеристики клеточного состава слизи. Вне сезона цветения растений при отсутствии интеркуррентных острых респираторно-вирусных инфекций пациентам проводились  скарификационные кожные тесты с водно-солевыми экстрактами пыльцевых аллергенов. Степень сенсибилизации оценивали по выраженности местной реакции  на ладонной поверхности предплечья через 20 минут после постановки проб. Учет осуществляли в баллах: 0 — размеры и внешний вид местной реакции аналогичен реакции в контроле; 1 — волдырь размером 2–3 мм в месте скарификации, заметен только при натягивании кожи; 2 — волдырь не более 5 мм, окруженный гиперемией в месте скарификации, отчетливо заметен при натягивании кожи; 3 — волдырь 6–10 мм, окруженный гиперемией; 4 — волдырь более 10 мм.

При характеристике параметров врожденного иммунитета в периферической циркуляции оценивали количество натуральных киллеров (CD3^-CD16⁺), число их цитолитически активных форм, содержащих внутриклеточные гранулы гранзима В (CD3^-CD16⁺GrB⁺), количество моноцитов, несущих TLR2 (CD14⁺CD282⁺) и TLR4 (CD14⁺CD284⁺) рецепторы для распознавания паттернов. С этой целью применяли проточную цитофлюориметрию, используя Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, США) и соответствующие поставленным задачам наборы моноклональных антител с двух и трехцветной меткой (производство Beckman Coulter, США).  Образование активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами фиксировали с помощью НСТ-теста, оценивая при этом спонтанные значения (НСТ сп), результаты, полученные в условиях дополнительной стимуляции нейтрофилов in vitro (НСТ ст) и расчете коэффициента стимуляции К ст. (НСТ ст./НСТсп.). Количественную оценку содержания в сыворотке крови цитокинов TNF-α, IL-6, IL-4, IFN-γ определяли методом иммуноферментного анализа на тест-системах «Вектор-Бест» (РФ).

В качестве контрольной группы однократно оценены соответствующие показатели иммунной системы практически здоровых доноров крови, не имеющих указаний на наличие в анамнезе соматической патологии, в том числе аллергии.

Статистическая обработка данных проводилась при помощи программного пакета «Statistica for Windows 6.1» (StatSoft, США).  На первом этапе проводили описательную статистику при помощи разведочного анализа, оценивали характер распределения количественных данных согласно критерию Шапиро-Уилка (так как объемы выборок были >50 человек). В случаях, когда выборка подчинялась нормальному закону распределения (НЗР), усредненные данные представляли в виде математического ожидания (М) и стандартного отклонения (SD) М±SD. Если же выборка не подчинялась НЗР, то в описании использовали медиану (Me) и 25-й 75-й перцентили (Q₁:Q₃), представляя данные в виде Me [Q₁;Q₃]. После этого проводили попарный сравнительный анализ независимых данных, сравнивая поочередно группу с легкой степенью тяжести течения / контрольную группу, группу со среднетяжелым вариантом течения / контрольную группу, группу с легкой степенью / группу со среднетяжелым вариантом. Если распределение данных (по каждому фактору) подчинялось НЗР в обеих сравниваемых группах, для проверки уровня значимости различий применяли параметрический t-критерий Стьюдента. Если же хотя б в одной из двух сравниваемых групп данные фактора не были распределены по НЗР,, а также когда обе выборки не подчинялись НЗР, применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия между группами считались статистически значимыми при р≤0,05, в обратном случае различия считались статистически не значимыми (р>0,05).

Результаты

Данные клинической характеристики пациентов позволили выделить две группы обследуемых: I группа (34 человека) — с легкой степенью тяжести течения САР, II группа —  (28 человек) со среднетяжелым вариантом течения. Пациенты были сопоставимы по возрасту (30±5,5 и 33±5,7 лет соответственно), полу (мужчин — 41 и 46; женщин — 59 и 54),  стажу болезни (7,7±2,7 и 10,8±3,5 лет), длительности острого периода течения САР (2,9±1,7 и 3,6±1,9 месяцев), наличию наследственной предрасположенности по результатам аллергоанамнеза (47% и 46%).

У всех пациентов с легким вариантом клинического течения САР отмечены ринорея, ощущения жжения и щекотания в носу, затруднение носового дыхания, зуд, приступообразное чихание. Данные анализа таблиц основных симптомов показали, что наиболее значимым является заложенность носа, а балл, отражающий этот признак, при немедленной оценке выражен меньше (i-TNSS 1,59±0,5 вечером, 1,59±0,5 утром), чем при ретроспективной (r-TNSS — 1,97±0,30 вечером и 1,94±0,34 утром). Сумма баллов i-TNSS (1,29±0,14) также была несколько ниже, нежели общий балл шкалы r-TNSS, составивший 1,44±0,21. Среднее значение общего балла опросника оценки качества жизни RQLQ в подгруппе пациентов составило 80,6±8,86, что практически в два раза меньше максимально возможного при использовании данного теста. Также следует отметить, что наибольшее среднее значение имеет показатель, отражающий неудобства, вызванные общими симптомами болезни (17,2±3,45), а наименьшее (7,1±1,82) — с нарушениями сна.

Анализ показателей врожденного звена иммунного ответа демонстрирует повышение продукции нейтрофильными гранулоцитами активных форм кислорода. Этот факт подтверждается увеличенным в сравнении с контрольными параметрами показателем спонтанного НСТ-теста (97.0 [ 90.0; 107.0] у.е., в контроле 90 [ 88; 91], p=0,012). В то же время при дополнительной стимуляции нейтрофилов в условиях in vitro, кислородпродуцирующая активность ниже (150.0 [ 142.0; 171.0] у.е.), чем у здоровых (203[ 192;217], p=0,011). Данный факт находит свое отражение в сниженном значении коэффициента стимуляции НСТ (1.60 [ 1.50; 1,70], в контроле 2.0 [ 1.8; 2.1], p=0,011). Характер изменений показателей лимфоидного компонента врожденной иммунной защиты демонстрирует сохранность количественных параметров НК: относительное число циркулирующих CD16⁺-лимфоцитов не отличается от данных контрольной группы (соответственно 10.50 [ 7.00; 13.00] и 12 [ 10.00; 13.00], p=0,86). В то же время следует отметить угнетение функциональных свойств этих клеток, что более заметно подтверждено снижением абсолютного количества НК, содержащих литические гранулы гранзима В (0.084 [ 0.058;0.124] 10⁹/л, в контроле 0.14 [ 0.11; 0.16], p=0,011). Данные, отражающие способность моноцитов периферического кровотока к распознаванию патогенассоциированных паттернов, не отличались от контрольных значений количества CD14⁺CD282⁺ (59.5[ 49.0; 70.0] и 64 [ 55.0; 70.0], p=0.15) и CD14⁺CD284⁺-клеток (20.0 [ 11.0; 30.0]% и 20 [ 15.0; 23.0], p=0.078). Следует отметить также отсутствие статистически значимых различий и в показателях содержания в сыворотке крови медиаторов иммунных реакций.

У пациентов второй подгруппы наблюдения, которую составили больные со среднетяжелым вариантом течения САР, показатели объективизации симптоматики TNSS варьировались вокруг максимального уровня (3 балла). В наибольшей степени был выражен критерий «заложенность носа», что отмечалось как при ретроспективной (r-TNSS 2,96±0,19 вечер и 2,93± 0,26 утро), так и при немедленной оценке (i-TNSS 2,96±0,19 вечер и 3,00± 0,00 утро). Весьма наглядно выглядит и показатель общего балла RQLQ: его среднее значение в подгруппе лишь на 15% меньше максимально возможного, составляя 143,2±5,28. При этом большая часть баллов определяется за счет показателя «общие симптомы» (34,8±3,87).

При характеристике параметров клеточных факторов врожденной системы защиты не выявлено изменений рецепторной экспрессии моноцитами периферической крови по отношению к практически здоровым. Так, относительное количество CD14⁺CD282⁺ (60.50 [ 50.50; 68.00] %) и CD14⁺CD284⁺мононуклеаров (20.00 [ 12.05; 29.50]%) не отличается от контроля (соответственно 64 [ 55.0; 70.0]% при р=0,68 и 20 [ 15.0; 23.0]% при р=0,87),  также в пределах значений практически здоровых доноров количество циркулирующих НК, спонтанная метаболическая активность нейтрофилов. В то же время функциональный потенциал этих клеточных линий снижен. Данный факт документирует снижение значения стимулированного НСТ-теста (136.0 [ 127.0; 163.5] у.е., в контроле 203 [ 192;217] у.е., p=0,011), также как и коэффициента стимуляции НСТ (1.50 [ 1.40;1.60], в контроле 2.0 [ 1.8;2.1], p =0,019). Кроме того, регистрируется снижение относительного числа циркулирующих цитолитически активных НК (CD16⁺Gr⁺, % 6.00 [ 4.00; 10.00], в контроле 10 [ 8; 12], p=0,02). Анализ цитокинового спектра сыворотки крови свидетельствует о сдвигах этой системы иммунного реагирования: статистически значимо увеличено содержание провоспалительных медиаторов IL-6: 7.3 [ 5.1;9.4] пг/мл, в контроле 2.0[ 1.2;2.4], p=0,01 и TNF-α [ 2,3 [ 1.7;3,4] пг/мл, в контроле 1.6[ 1.4;1.9], p=0,01. Кроме того, повышены значения иммунорегуляторных оппозитных цитокинов IFN-γ (8.9 [ 7.0;11.2] пг/мл, в контроле 6.2[ 4.9;6,8], p=0,02) и IL-4 (3.2 [ 1.9;4.3], пг/мл, в контроле 2.1[ 1.0;2.4], p=0,03).

При решении задачи поиска отличительных признаков в реакции системных показателей врожденного иммунитета в зависимости от варианта течения сезонного аллергического ринита, проведено сопоставление данных, характеризующих легкую степень клинического течения со среднетяжелым вариантом САР в стадию обострения аллергического воспаления. Сравнение клинической картины, основанное на сопоставлении баллов оценочных шкал, выявило статистически значимые различия в критериях i-ТNSS, отражающих каждый из симптомов, их средние значения как утренних, так и вечерних показателей, а также общий балл: при легком варианте САР его значение составляет 1,29±0,14, а при среднетяжелом — 2,70±0,16, р<0,001. Аналогичная динамика прослеживается при сопоставлении результатов r-TNSS в значениях, характеризующих не только каждый из симптомов, но и общий суммарный балл средних значений утренних и вечерних показателей (1,44±0,21 при легком варианте, 2,65±0,27 — при среднетяжелом, р<0,001 соответственно). Убедительно выглядит также и сопоставление данных оценки качества жизни. Так, при легкой степени клинического течения значения критериев RQLQ составляют от 30 до 60% от общей суммы баллов, а при среднетяжелом варианте разброс значений не более 10% при общем увеличении до 85–90%.

Сопоставление показателей клеточного звена врожденного иммунитета у больных легкой и среднетяжелой формами САР не выявило отличий в продукции активных форм кислорода нейтрофильными фагоцитами, в экспрессии моноцитами периферической крови Toll-подобных рецепторов 2 и 4, в количестве циркулирующих НК и цитолитически активных гранзимпозитивных CD16⁺-лимфоцитов. В то же время у больных среднетяжелой формой в сравнении с пациентами с легким вариантом клинического течения фиксируется увеличение содержания в сыворотке крови всех анализированных в работе цитокинов. В большей степени этот факт отличает провоспалительный медиатор ИЛ-6 (табл. 1).

Известен факт наличия персистирующего воспаления слизистой носа у пациентов с САР даже при отсутствии причинно-значимого аллергена [17][18]. Это обстоятельство определил интерес к анализу показателей врожденного иммунного ответа у этих же пациентов, но в стадии ремиссии. Нами установлено, что при легком варианте течения САР в сравнении с контрольными параметрами практически здоровых доноров снижена продукция активных форм кислорода нейтрофилами в тесте дополнительной стимуляции in vitro (НСТ ст., у.е. 141,5[ 125,0; 156,0] у.е., в контроле 203[ 192;217], p=0,012). В то же время показатели спонтанного НСТ-теста между группами не отличаются (соответственно 93,0[ 80,0; 98,0] у.е. и 90 [ 88; 91], у.е., p=0,89). Также обращает внимание значение параметра, отражающего функциональные свойства лимфоидной субпопуляции врожденного иммунитета. В циркуляции снижено количества CD16⁺Gr⁺-клеток (5,0[ 4,0; 8,0%, в контроле 10 [ 8; 12], p=0,01). В то же время не зарегистрированы статистически значимые различия экспрессии TLR 2 и TLR 4 клетками моноцитарного ряда, нет отличий и в сывороточном содержании медиаторов иммунных реакций. В период ремиссии САР среднетяжелого варианта течения  в сравнении с контрольной группой снижены показатели стимулированного НСТ-теста (136,0 [ 127,0; 163,5] у.е., p=0,02), фиксируется уменьшение доли функционально активных CD16⁺Gr⁺-лимфоцитов (7,30 [ 3,50; 9,50] %, p=0,014) при сохранности в сравнении со значениями контроля количественных показателей НК, экспрессии клетками моноцитарного ряда TLR2 и  TLR4, содержания в сыворотке крови цитокинов IL-4; IL-6; IFN-γ; TNF-α. Сопоставление данных, отражающих функциональные потенции клеточных компонентов врожденного иммунитета в условиях ремиссии САР средней и легкой степени тяжести, не выявило статистически значимых отличий метаболической активности нейтрофилов, моноцитарной экспрессии TLR 2 и TLR4, литических свойств НК, цитокинового профиля сыворотки крови.

Обсуждение

Стадия обострения САР легкой степени тяжести манифестирует усиление метаболической активности нейтрофильного звена и ослабление их адаптационных ресурсов по отношению к параметрам практически здоровых. Снижение функциональных потенций также отличает популяцию натуральных киллеров. У больных САР средней степени тяжести течения в стадию обострения в сравнении с контрольными цифрами изменения функционирования иммунной системы проявляются снижением резервов метаболической активности нейтрофильных фагоцитов и литических потенций натуральных киллеров. Весьма значимым фактором служит системная активация продукции цитокинов как провоспалительной, так и регуляторной направленности, при этом в большей степени увеличено содержание в периферическом кровотке IL-6, также весьма интересен факт усиления синтеза медиаторов как Th1, так и Th2 профиля. Следует отметить, что именно это обстоятельство — продукция медиаторов иммунного ответа — отличает системную реакцию врожденного иммунного ответа в зависимости от степени тяжести клинического течения САР. Весьма важным результатом проведенного наблюдения является детекция изменений функционирования клеток врожденного иммунного ответа у больных САР по сравнению с контрольными критериями в отсутствие причинно-значимых аллергенов. Изменения у больных легкой степени в период клинической ремиссии определяются снижением показателей эффекторных потенций нейтрофилов и натуральных киллеров. В условиях отсутствия палинации и клинических проявлений САР среднетяжелого варианта течения продолжает фиксироваться угнетение адаптационных резервов кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов и цитолитического потенциала НК-клеток, а принципиальных отличий от данных аналогичного периода у пациентов с легким вариантом течения не зафиксировано. Если особенности функционирования иммунной системы у больных САР в стадию обострения оправданы текущим аллергическим воспалением, то отличные от контрольных данных количественные и функциональные показатели врожденного иммунитета в стадии клинической ремиссии являются объективным доказательством нарушения системного иммунного реагирования даже в условиях отсутствия причинно-значимого аллергена и на самых ранних стадиях болезни.

Заключение

Совокупность представленных данных позволяет констатировать, что изменения реагирования клеточных компонентов врожденного иммунного ответа у больных САР формируются на самых ранних этапах клинической манифестации, стабильны вне сезона палинации и степени тяжести, ключевым проявлениями прогрессии является цитокиновый дисбаланс. Угнетение адаптационного потенциала нейтрофильных фагоцитов, литической активности натуральных киллеров может играть значимую роль при развитии осложнений САР, обусловленных вторичной иммунной недостаточностью.