Клинико-диагностическое значение маркеров апоптоза при инфаркте миокарда на фоне хронической обструктивной болезни лёгких

Введение

В настоящее время существенно увеличивается распространённость заболеваний, при которых развивается коморбидное состояние, в частности на фоне хронической обструктивной болезни лёгких (ХОБЛ). Часто это приводит к летальному исходу [1]. ХОБЛ, по ряду клинических и лабораторных показателей, усугубляет течение абсолютного большинства известных сегодня заболеваний. В длинном списке болезней, сопутствующих ХОБЛ, сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), как правило, считаются наиболее значимыми. Среди пациентов с ХОБЛ сосуществующие ССЗ неизменно связаны с более высокими показателями госпитализации, внутрибольничной смертности и повторной госпитализации в течение 30 дней, а также с увеличением продолжительности пребывания в стационаре [2]. Кроме того, наличие ССЗ повышает риск и продолжительность обострений ХОБЛ [3], а возникновение этих обострений, в свою очередь, увеличивает риск последующих сердечно-сосудистых нарушений [4].

Основной причиной ХОБЛ является курение сигарет, которое, как известно, вызывает эндотелиальную дисфункцию. У пациентов с ХОБЛ наблюдаются изменения в эндотелии, как в лёгочном, так и в системном кровообращении, что может предрасполагать к лёгочной гипертензии и/или сердечно-сосудистым событиям [5][6]. Проблема сочетанной патологии ИБС и ХОБЛ сложна и до сих пор недостаточно изучена. Несомненно, рассматриваемые патологические состояния утяжеляют течение чего? и ускоряют темпы взаимного развития.

Понимание патогенетических аспектов, связывающих ХОБЛ и различные формы ССЗ, за последнее десятилетие значительно расширилось [7][8], но механизмы, которые лежат в их основе, недостаточно понятны. К ключевым относятся общие факторы риска, хроническое системное воспаление, гиперинфляция лёгких, тканевая гипоксия, лёгочная гипертензия, окислительный стресс, а также генетические факторы и фенотип ХОБЛ [9]. Одним из общих механизмов, привлекающих всё большее внимание исследователей, является апоптоз. Фактически апоптоз эндотелиальных клеток — это один из факторов, способствующих развитию эмфиземы лёгких, и дополнительный критерий повреждения эндотелия и гемостаза. При ИМ апоптозу принадлежит решающая роль в реализации поражения сердца.

Часто используемым маркером апоптоза является аннексин V. Это кальций-зависимый гликопротеин с сильной антикоагулянтной способностью, проявляющейся in vitro. Данное свойство обусловлено способностью аннексина V вытеснять белки свёртывания с поверхности фосфолипидов, продлевая фосфолипид-зависимые реакции свертывания. Аннексин V обладает высоким сродством к апоптотическим структурам благодаря тому факту, что они продуцируют большое количество фосфолипидов, в частности фосфатидилсерина (ФС). Это было подтверждено в различных исследованиях как in vitro [10], так и in vivo [11]. Aннексин V является белком с положительным потенциалом, который с высокой аффинностью и специфичностью связывается с отрицательно заряженным ФС на поверхности апоптотических клеток. При флуоресцентной индикации аннексина V фосфолипиды могут быть обнаружены с помощью цитометрии потока. Имеются данные о возможности применения аннексина V для мониторинга апоптоза в реальном времени [12].

В регуляции процессов апоптоза участвуют индуцируемые стрессом белки теплового шока (БТШ), одним из основных представителей которых является белок теплового шока с массой 70кДа (БТШ70). БТШ70 — это белок самосохранения, который поддерживает клеточный гомеостаз в условиях стресса. Он действует как молекулярный шаперон, играя важную роль в укладке, сборке, транспорте и деградации белка. Он же помогает предотвратить денатурацию и агрегацию белка [13]. Однако роль этого белка не сводится только к антиапоптическому эффекту. Имеются свидетельства того, что он способен проявлять также противоположные проапоптические свойства. То есть механизмы взаимосвязи апоптоза и экспрессии БТШ при заболеваниях сердца остаются во многом не ясными.

Лучшее понимание обстоятельств, которые вызывают апоптоз во время инфаркта миокарда и после него, а также понимание клеточных механизмов, которые контролируют апоптоз, может привести к новым терапевтическим стратегиям, ограничивающим повреждение тканей миокарда при инфаркте.

Цель исследования — изучить уровни БТШ70 и зависимого от аннексин V апоптоза клеток при ИМ с различным течением заболевания и на фоне сопутствующей ХОБЛ.

Материалы и методы

Было обследовано 65 больных ИМ; у 37 из них ИМ развился на фоне ХОБЛ, у 28 не имелось ХОБЛ в качестве сопутствующего заболевания. Наблюдение за больными осуществлялось в региональном сосудистом центре ГБУЗ АО Александро-Мариинской областной клинической больницы г. Астрахани в период с 2018 по 2019 гг. Перед включением в исследование от всех пациентов было получено письменное информированное согласие на участие в нём.

Медиана возраста обследованных составила 52,8 [ 45,8; 60] года. Диагноз ИМ устанавливался на основании клинических рекомендаций «Четвёртое универсальное определение инфаркта миокарда» Европейского общества кардиологов (2018 г.). Критериями включения в основные группы являлись возраст до 60 лет, I тип ИМ. В исследование не включались пациенты с другими типами ИМ, с терминальной печёночной и почечной недостаточностями (скорость клубочковой фильтрации менее 30 мл/мин.), онкологическими заболеваниями.

В группе больных ИМ на фоне ХОБЛ диагноз «Лёгочная патология», а также тяжесть течения ХОБЛ были верифицированы ранее. Все больные с ХОБЛ имели II–III стадии заболевания вне обострения. Диагноз ХОБЛ устанавливался в соответствии с программой «Глобальная стратегия диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни лёгких» (пересмотр 2019 г.). Медиана длительности ХОБЛ составила 17,5 [ 7,4; 24,6 ] лет. У всех пациентов отмечалось курение в анамнезе. На момент госпитализации курящими были 87,8% пациентов с ХОБЛ. Средний индекс курения составил 34,6 пачка-лет. В 96% случаев наблюдаемыми были мужчины с длительным анамнезом курильщика на момент исследования.

Для изучения взаимосвязи изучаемых показателей у больных с ИМ в зависимости от подъема на ЭКГ сегмента ST обследуемые были разделены на подгруппы — с подъёмом ST и без. Среди больных ИМ без сопутствующей ХОБЛ у 14 человек был диагностирован ИМпST и у 14 — ИМбпST. Среди больных ИМ на фоне ХОБЛ у 19 человек был диагностирован ИМпST, у 18 — ИмбпST.

Группа контроля была представлена 30 соматически здоровыми лицами, проходившими обследование в поликлиниках г. Астрахани. Лица группы контроля были сопоставимы с группой больных ИМ по возрастно-половому составу и являлись соматически здоровыми.

Клиническое исследование было одобрено Региональным Независимым Этическим комитетом (от 15.09.2016, протокол № 1). Исследование было проведено в соответствии с международными стандартами GCP.

Для оценки количества апоптотических клеток использовался набор ANNEXIN V-FITC/7 AAD (Beckman Coulter, USA). Принцип действия реагентов основан на высоком сродстве аннексина V и ФС и специфичном связывании 7-аминоактиномицина (7AAD) с нуклеотидными парами гуанин-цитозин в ДНК. Выделение мононуклеаров осуществляли с помощью центрифугирования венозной крови на градиенте плотности «Фикол-гипак» Pharmacia Fine Chemicals (Швеция). Среди популяции лимфоцитов определяли клетки, находящиеся в апоптозе и/или некрозе, с помощью двумерных гистограмм. Апоптоз анализировали в процессе проточной цитометрии с использованием проточного цитометра «Navios» (Beckman Coulter, USA). Контроли, включённые в настройку компенсации и квадранты, представляли собой клетки, окрашенные только аннексином V FITC, и клетки, окрашенные только 7ADD. Клетки были определены как интактные, то есть жизнеспособные клетки (AV-/7AAD-), клетки на ранней стадии апоптоза (AV+/7AAD-), клетки на поздней стадии апоптоза (AV+/7AAD+), погибшие клетки (AV-/7AAD+). Каждую субпопуляцию выражали как процент от общей численности мононуклеаров. Концентрацию белка БТШ70 (нг/мл) определяли в сыворотке крови методом ИФА с помощью набора («Enzo Life Science», США) на микропланшетном фотометре «Invitrologic» (Россия) с использованием промывателя планшет «Stat Fax 2600» (США) и шейкера-встряхивателя «ST-3 SkyLine» (Латвия).

Статистическую обработку данных проводили с применением программы STATISTICA 10.0. Описательные характеристики представлены медианой, 25-м и 75-м перцентилями. Для сравнения двух независимых групп использовался анализ ранговых вариаций с применением непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни, трех и более групп — с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Отличия считались статистически значимыми при р <0,05.

Результаты

При анализе содержания циркулирующих аннексин V-мононуклеаров в периферической крови у больных ИМ и здоровых лиц было установлено, что наибольшее число апоптотических клеток выявляется при ИМ на фоне ХОБЛ (рис. 1).

В этой группе больных содержание апоптотических мононуклеаров составило 6,5 [ 3,4–12,3 ] %, что было статистически значимо выше как по сравнению с группой контроля, где содержание этих клеток составило 1,6 [ 0,8–2,4 ] % (р <0,001), так и с больными ИМ без ХОБЛ — 3,7 [ 2,1–4,9 ] % (р<0,01). У больных с ИМ без ХОБЛ также отмечались статистически значимые различия с группой контроля (р<0,01). Статистически значимых различий в содержании других циркулирующих мононуклеаров, как жизнеспособных (интактные клетки), так и клеток на поздней стадии апоптоза и погибших клеток, не выявлено .

При исследовании уровня БТШ70 установлено, что у больных с ИМ независимо от сопутствующей бронхолегочной патологии этот показатель был значимо выше по сравнению с группой здоровых лиц, причём наиболее высокий его уровень отмечался в группе ИМ на фоне ХОБЛ (рис. 2).

У лиц в этой группе уровень БТШ70 составил 0,95 [ 0,71–1,56 ] нг/мл, что было достоверно выше как по сравнению с группой ИМ без ХОБЛ — 0,48 [ 0,36–0,98 ] нг/мл (р <0,05), так и с группой контроля — 0,12 [ 0,05–0,37 ] нг/мл ( р<0,01). В группе больных ИМ без ХОБЛ также отмечался статистически значимо (р <0,01) более высокий уровень БТШ70 по сравнению с группой контроля.

При изучении взаимосвязи уровней аннексин-зависимового апоптоза у больных с ИМ от подъёма сегмента ST было установлено (табл. 1), что у больных с ИМ с подъёмом ST независимо от сопутствующей бронхолегочной патологии отмечается повышение содержания апоптотических клеток.

При ИМпST число клеток, находящихся на стадии раннего апоптоза, составило 3,9 [ 2,3–4,9] %, что было достоверно (р <0,05) выше, чем в группе больных ИМбпST, где этот показатель составил 2,4 [ 1,8–3,1] %. Самое значительное повышение числа апоптотическихклеток на этой стадии апоптоза отмечалось при ИМ с подъёмом сегмента ST в группе коморбидных больных — 7,6 [ 4,4–12,3] %, что статистически значимо превышало данный показатель как у больных ИМбпST (р <0,01), так и у больных ИМпST (р <0,05).

В коморбидной группе ИМбпSTна фоне ХОБЛ этот показатель составил 5,9 [ 3,1–9,7] %, что было достоверно выше (р <0,05) данного показателя в группе больных ИМбпST. При сопоставлении содержания погибших клеток выявлено, что в коморбидной группе с подъёмом сегмента ST их число было значимо выше (р <0,05) по сравнению со всеми группами больных. Статистически значимых различий в содержании других клеток не выявлено.

При анализе зависимости уровня БТШ70 от подъёма сегмента ST (табл. 2) установлено, что у больных ИМпST на фоне ХОБЛ отмечался самый высокий его уровень, который составил 1,22 [ 0,95–1,56] нг/мл.

Этот показатель был значимо выше как по сравнению с группой ИМпST, где он составил 0,57 [ 0,46–0,98] нг/мл (р <0,05), так и с группой ИМбпST — 0,41 [ 0,36–0,69] нг/мл (р <0,01). Кроме того, статистически значимые различия отмечались с группой ИМбпSTна фоне ХОБЛ — 0,81 [ 0,71–1,2] нг/мл (р <0,05).

В группе ИМ отмечалось статистически значимое повышение уровня БТШ70 у больных с подъемом ST по сравнению с группой ИМбпST — 0,41 [ 0,36–0,69] нг/мл (р <0,05). Во всех группах больных уровень БТШ70 был значимо выше у больных с подъёмом сегмента ST по сравнению с больными без подъёма.

Обсуждение

Более 70% лиц старше 65 лет имеют мультиморбидные заболевания, и в значительной части случаев по крайней мере одно из заболеваний имеет сердечно-сосудистую основу [14]. Типичный пациент с ХОБЛ с такой же вероятностью может умереть от сердечно-сосудистой причины, как и от респираторной [15].

Ранее было показано, что при ХОБЛ наблюдается увеличение числа клеток, вступивших в апоптоз, что обусловлено высоким уровнем проапоптотических факторов и вследствие этого активацией апоптоза [16]. При ИМ отмечается усиление апоптоза эндотелия с увеличением прокоагулянтной активности крови [17].

ИМпST является наиболее тяжёлым исходом коронарной болезни, на него приходится 12,8% всех смертей во всем мире [18]. В процессе ишемического повреждения наряду с некротической гибелью кардиомиоцитов имеет место активизация процесса апоптоза [19]. Апоптоз начинается в течение нескольких минут после ишемии и предшествует некрозу. Апоптоз характеризуется усадкой клеток, деструкцией хроматина и систематическим расщеплением ДНК. В апоптотический процесс могут в равной степени вовлекаться кардиомиоциты, интерстициальные и эндотелиальные клетки. Некоторые авторы предполагают, что постнекротический апоптоз сохраняется длительное время, он является ответственным за желудочковое ремоделирование и прогрессирование сердечной недостаточности [20]. Выявленное нами повышение числа аннексин V-положительных мононуклеаров в крови при ИМ происходит, вероятно, в результате эндотелиального повреждения, связанного с разрушением атеросклеротической бляшки. Аннексин V, связываясь на поверхности апоптотических клеток с ФС, повышает защитную реакцию, направленную на снижение риска тромбоза с активацией прокоагулянтных реакций [21].

Основным фактором, вызывающим экспрессию БТШ70, является ишемия. Продукция БТШ70 в этих условиях может быть расценена как механизм адаптации миокарда к повреждениям. Wei Y. и соавт. продемонстрировали, что повышение экспрессии БТШ70 в кардиомиоцитах часто развивается вследствие ишемической или дилатационной кардиомиопатии [22]. Повышение уровня БТШ70, выявленное в нашем исследовании, вероятно, связано с антиапоптотическими свойствами белка БТШ70. Показано, что БТШ70 может защитить клетки от апоптоза, вызванного действием TNF-α, после активации эффекторных каспаз и задержать процесс гибели, вызванной цитохромом С, в том числе в отношении кардиомиоцитов [23].

Заключение

Выявленное в нашем исследовании у обследуемых больных повышение в крови численности аннексин V-ассоциированных апоптотических клеток и содержания белка БТШ70, способствующего устойчивости к воздействию гипоксии и оптимизации реперфузии, вероятно, является проявлением защитной реакции, направленной на снижение тромбогенного потенциала крови при ИМ. Мы полагаем, что большее количество аннексин V-положительных мононуклеаров и более высокий уровень БТШ70 в крови больных ИМпST по сравнению с больными ИМбпST обусловлены объёмом поражения миокарда. Ведь известно, что при ИМбпST имеет место неокклюзирующий тромбоз коронарной артерии, в то время как развитие ИМпST обусловлено полной тромботической окклюзией коронарной артерии. Более высокие значения исследуемых биомаркеровв группе коморбидных больных ИМ на фоне ХОБЛ по сравнению с лицами, у которых имел место ИМ без фоновой ХОБЛ, можно связать с интенсификацией процесса апоптоза на фоне хронического системного воспаления, которое ухудшает клиническое течение обоих заболеваний.