Особенности протеомного профиля сыворотки крови детей с бронхиальной астмой, перенесших перинатальное поражение центральной нервной системы

Введение

В последние годы уделяется большое внимание изучению состояния здоровья детей, перенес­ших перинатальное поражение ЦНС. По дан­ным современной литературы, новорожденные, пере­несшие гипоксию-ишемию в перинатальном периоде, в последующие периоды детства имеют неврологический дефицит различной степени тяжести в виде задерж­ки нервно-психического и двигательного развития, минимальных дисфункций мозга, нарушений соци­альной адаптации, детского церебрального паралича, эпилепсии [1][2]. В то же время, у детей и подростков с последствиями перинатального поражения ЦНС часто имеются функциональные изменения со стороны раз­ных органов и систем [3]. В качестве сопутствующих состояний отмечаются заболевания гепатобилиарной системы, желудочно-кишечного тракта, сердечно-со­судистой, иммунной систем. В последнее время осо­бое внимание уделяется патологии бронхолегочной системы, в том числе такому тяжелому хроническому заболеванию как бронхиальная астма. Доказано, что перинатальные повреждения способствуют частому развитию бронхиальной обструкции у детей первых лет жизни [4]. Однако, для того чтобы полностью раскрыть патогенетические механизмы формирования БА у де­тей, необходимо комплексное обследование с примене­нием современных методов диагностики.

Цель исследования — протеомный анализ сыворот­ки крови детей с БА, имеющих в анамнезе указание на па­тологию центральной нервной системы в перинатальном периоде.

Материалы и методы

Для реализации поставленной цели на базе педиатри­ческого отделения клиники Ростовского государствен­ного медицинского университета были обследованы 124 пациента с установленным диагнозом БА. Диагноз БА был верифицирован согласно Национальной программе «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и про­филактика», 2017 [5]. Из числа обследованных пациен­тов были выбраны дети со среднетяжелым и тяжелым течением заболевания, имеющие указание в анамнезе на перенесенную патологию ЦНС перинатального периода. Контрольную группу составили пациенты I и На групп здоровья, сопоставимые по полу и возрасту с основной выборкой обследованных больных. Средний возраст де­тей составил 11,0 ± 0,73 лет.

Критерии включения: наличие подтверждённого ди­агноза БА, поставленного не ранее чем за 6 месяцев до обследования пациентов; наличие в анамнезе патологии перинатального периода, отсутствие сопутствующих хронических заболеваний со стороны других органов и систем.

Критерии исключения: больные с неуточнённым диагнозом БА; больные БА с другими хроническими и острыми заболеваниями легких (туберкулёз, острый трахеобронхит, пневмония и др.); возраст пациентов больше 18 лет.

Всем пациентам проведено комплексное клинико-ла­бораторное исследование, включающее сбор анамнести­ческих данных, физикальный осмотр, определение обще­го и аллергенспецифических IgE, а также исследование функции внешнего дыхания с применением пикфлоуметрии, спирографии и бодиплетизмографии. Все исследо­вания выполнены по стандартным методикам.

В группе больных БА с патологией перинатального периода также проведено протеомное исследование сыво­ротки крови. Материалом для исследования служила сы­воротка крови, аликвоты которой хранили в присутствии коктейля ингибиторов протеаз (Thermo Fisher Scientific, США) при -86 °С до проведения исследования. Обедне­ние сыворотки (удаление альбумина и иммуноглобулина G) проводили с использованием коммерческих наборов Aurum Serum Protein Mini Kit (Bio-Rad, США) согласно протоколу фирмы производителя. Затем обедненные об­разцы концентрировали и обессоливали на пористых фильтрах Amicon Ultra 10кДа (Millipore, США).

Фракционирование белков сыворотки проводили методом двумерного электрофореза (2Д-ЭФ) в полиа­криламидном геле [6]. Первое направление 2Д-ЭФ — изоэлектрофокусирование — осуществляли с исполь­зованием иммобилиновых стрипов с градиентом рН = 3-10 (ReadyStripIPGStrips, «Bio-Rad», США) на приборе Protein IEF Cell («Bio-Rad», США). Второе направление электрофореза (вертикальный ДДС-Na-электрофорез в 12,5 % ПААГ) проводили в камере Protean II xi Multi-Cell («Bio-Rad», США) при силе тока 10 mA на гель в тече­ние 18 часов. Для визуализации белковых пятен в гелях (после завершения 2-ого направления 2Д-ЭФ), электро- фореграммы окрашивали флуоресцентным красителем Flamingo («Bio-Rad», США) согласно протоколу произво­дителя, сканировали на приборе ChemidocMP (Bio-Rad, США) и сохраняли в TIFF-формате. Анализ гелей, вклю­чающий сопоставление пятен на электрофореграммах, полученных из разных образцов, проводился с помощью специальной программы компьютерного анализа изо­бражений PDQuest версии 8.0.1. (Bio-Rad, США).

Белковые пятна, представлявшие интерес, вырезали из геля, подвергали трипсинолизу согласно методике [7] и смешивали с матрицей. В качестве матрицы исполь­зовалась 2,5-дигидроксибензойная кислота (Bruker, Гер­мания). Масс-спектры триптических гидролизатов бел­ков были получены на MALDI-TOF-масс-спектрометре Microflex LRF (Bruker Daltonics, Германия). Для получе­ния и анализа масс-спектров использовали программы FlexControl версии 3.4 и FlexAnalysis версии 3.4 (Bruker Daltonics, Германия). Для идентификации белков исполь­зовали программу BioTools версии 3.2 (Bruker Daltonics, Германия). По масс-листу каждого белкового пятна про­изводился поиск по базе данных Swiss-Prot (2013_12) с использованием локальной версии программы Mascot Search 2.4.1 (Matrix Science, США).

После вырезания белкового пятна из геля и процедуры трипсинолиза идентификацию белков проводили мето­дом MALDI-TOF-масс-спектрометрии [7]. Масс-спектры триптических пептидов получали на масс-спектрометре Autoflex II («Bruker Daltonics», Германия) и анализирова­ли с использованием опции Peptide Fingerprint програм­мы Mascot MS Search (Matrix Science, США) и баз данных

NCBI и Swiss-Prot, принимая точность определения массы ионов равной 0,01 %. Результаты идентификации белков принимались как достоверные при уровне значимости не менее 95 % и показателе сиквенс-покрытия не менее 60 %. Сравнительный анализ протеомных карт осуществля­ли по виртуальным интегрированным «мастер-гелям» двумерных электрофореграмм амниотической жидкости (программа PDQuest, «Bio-Rad», США).

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью лицензионного пакета программ Statistica (вер­сия 6.0. фирмы StatSoft. Inc.). Для оценки статистической значимости различий между сравниваемыми группа­ми использовали критерий Стьюдента (t-критерий) и c ²-критерий (для таблиц 2х2 — в точном решении Фише­ра). Достоверными считались различия при p < 0,05.

Результаты

Сравнительный анализ протеомного профиля сыво­ротки крови больных в анамнезе имевших перинаталь­ное поражение ЦНС, страдающих БА, и пациентов кон­трольной группы позволил установить, что продукция ряда белков снижена при указанной патологии, среди ко­торых были идентифицированы белки в диапазоне моле­кулярных масс 16-33 кДа (p<0,05): глутатионпероксидаза 3 (GPX3), транстиретин (TTHY), а также компоненты си­стемы комплимента С4B (CO4B) и С3 (CO3) [см. табл. 1].

Обсуждение

Глутатионпероксидаза 3 (GPx3) или плазматиче­ская глутатионпероксидаза — внеклеточный тетра- мерный Se-содержащий фермент. GPx3 восстанавливает перекись водорода до воды путем окисления глутатиона [8]. Кроме того, в отличие от каталазы, действие которой она дополняет, GPx3 способна обезвреживать в присут­ствии глутатиона также органические гидропероксиды, а именно перекиси липидов, образующиеся в результате воздействия свободных радикалов на полиненасыщенные липидные мембраны и продукты реакции, катали­зируемой липооксигеназой [8]. Кроме того, еще одним косубстратом для глутатионпероксидазы, как было по­казано, является S-нитрозоглутатион (GSNO), в резуль­тате реакции происходит высвобождение оксида азота [8]. S-нитрозоглутатион, в свою очередь, индуцирует экс­прессию гена GPx3, в то время как сверхэкспрессия суперокисддисмутазы предотвращает ее индукцию [8].

На долю GPx3 приходится почти 50 % от активности всех глутатионпероксидаз в лёгочной ткани и бронхах [9], что особенно важно, так как дыхательная система в силу своих структурных и физиологических особен­ностей подвергается множеству внутренних и внешних воздействий, приводящих к избыточной генерации ак­тивных форм кислорода (АФК) [10]. GPx3 необходима для удаления токсичных продуктов окисления липидов и H₂O₂, которые непрерывно генерируются в результате секвестрации и инфильтрации лейкоцитов в легких.

Проведенный протеомный анализ показал, что у всех больных БА отмечается снижение экспрессии данного белка в сыворотке крови по сравнению со здоровыми детьми (см. рис. 1). Причем полученные нами результа­ты согласуются с данным зарубежных исследователей. Так, в работе Youness E.R. и соавт. было показано, что у больных БА отмечается значимое снижение уровня GPx3 в сыворотке крови. При этом у больных с тяжелым те­чением ее значения гораздо меньше, чем у пациентов со среднетяжелым и легким течением [11]. В исследованиях, проведенных на пациентах с БА, проживающих в Туни­се также было показано значительное снижение уровня GPX3 активности в сыворотке крови [12]. Аналогичные данные получены у больных БА, проживающих в Египте [13]. Причем показано, что чем тяжелее течение заболе­вания, тем ниже концентрация данного фермента в сыво­ротке крови: при легкой БА — 27.95 ± 4.77 mU/mL, тогда как при среднетяжелом течении заболевания — 6.03 ± 0.90 mL.

Снижение экспрессии глатионпероксидазы 3 у паци­ентов основной группы, очевидно, свидетельствует об ис­тощении антиоксидантной защиты, что создает условия для дисбаланса в системе «оксиданты-антиоксиданты» и инициируют развитие окислительного стресса, одного из ключевых механизмов возникновения БА, а также может приводить к вторичным патологическим изменениям дыхательных путей и лёгочной ткани на фоне уже сфор­мировавшегося заболевания.

Идентифицированный нами транстиретин (TTHY) — тетрамерный белок, синтезируемый, в основном, в пече­ни, которая служит основным его источником в сыворот­ке, и сосудистом сплетении мозга. Он осуществляющий транспорт тироксина, а также витамина А (ретинола) по­средством связывания с ретинол-связывающим белком (RBP) [14]. Помимо транспортной активности, установ­лено, что транстиретин является протеазой [14]. Уста­новлено, что экспрессия печеночного TTHY подавляется, и, следовательно, уровень этого белка в сыворотке резко снижается во время острофазного ответа — процесса, характеризующегося быстрым перепрограммированием экспрессии генов и метаболизма в ответ на передачу сиг­налов воспалительных цитокинов [15].

Снижение продукции TTHY приводит к наруше­нию транспорта ретинола —биологически активной форме витамина А, избыток которого накапливает­ся именно в легочной ткани, приводя к образованию ретиноидных метаболитов (ретиноидов). Накопление последних в легочной паренхиме приводит к возрас­танию в крови содержания аутоантигенов, усилива­ется фагоцитоз и межклеточные кооперации, проли­ферация и функциональная активность лимфоцитов и полиморфонуклеаров, кроме того активируется хе­мотаксис и фагоцитарная активность нейтрофильных лейкоцитов, а также выброс ими лизосомных фермен­тов. Также ретиноиды способствуют дифференциров- ке эпителиальных клеток по мукоидному типу, а об­разующиеся в результате этого мукоциты интенсивнее секретируют слизь, что клинически проявляется зна­чительным нарушением бронхиальной проходимости у больных БА и является одним из компонентов брон­хиальной обструкции (ноздрин).

В результате проведенного протеомного анализа сы­воротки крови пациентов было установлено снижение концентрации данного белка у пациентов основной груп­пы, по сравнению с контрольной. Аналогичные резуль­таты были получены в рамках зарубежных исследований [16]. Причем снижение уровня TTHY также было заре­гистрировано в жидкости, полученной при бронхоаль­веолярном лаваже, у больных с легкой, среднетяжелой и тяжелой БА [17].

Изменение концентрации транстиретина в сыворотке крови у детей, перенесших в анамнезе перинатальное пора­жение ЦНС, свидетельствует о наличии нарушений в систе­ме иммунного ответа на молекулярном уровне и объясняет с точки зрения протеомных исследований почему у детей с симптомами экзогенных нарушений развития нервной си­стемы отмечаются значительные изменения как со стороны клеточного, так и гуморального иммунитета, способствую­щие развитию бронхолегочной патологии [18].

Снижение уровня в сыворотке крови у детей основ­ной группы установлено еще для двух белков — компо­нентов системы комплемента С3 и С4b — белков острой фазы, концентрация которых значительно изменяется во время воспаления и повреждения тканей. С3 участвует в классическом и альтернативном путях активации систе­мы комплемента, С4 — только в классическом пути. По­мимо их хемотаксической роли, они вызывают сокраще­ние гладкой мускулатуры, повышают гиперреактивность дыхательных путей и проницаемость сосудов, а также регулируют расширение сосудов в легких [19]. С3 и С4 фракции стимулируют высвобождение гистамина из базофилов и тучных клеток, а также регулируют синтез эо­зинофильного катионного белка и адгезию эозинофилов к эндотелиальным клеткам, что имеет важное значение в патогенезе БА. Одновременное снижение фракции С3 и С4b компонента связано с их потреблением и указывает на большее участие классического пути, по сравнению с альтернативным путем каскада активации комплемента при БА. Кроме того, сверхактивированный каскад ком­племента играет ключевую роль в качестве эффекторов клеточно-опосредованной и гуморальной иммунной системы при повреждении легочной ткани в патогене­зе астмы. Результаты наших исследований согласуются с данными авторов, которые также показали снижения концентрации 4-й фракции комплимента у больных не­атопической астмой [16].

Принимая во внимание тот факт, что перенесенная ребенком перинатальная гипоксия может привести не только к повреждению нервной системы, но и способ­ствовать нарушению становления и развития иммунной системы у детей старшего возраста и формированию бронхолегочной патологии в будущем. Гипоксия «за­пускает» механизмы системного воспалительного отве­та сначала в локальной зоне, а затем в других органах- «мишенях», что приводит к нарушению барьерных функций, иммунной дезадаптации [20][21]. Таким обра­зом, можно предположить, что снижение концентрации С3 и С4 фракций комплимента у обследованных детей является последствием перенесенных ранее перина­тальных поражений ЦНС.

Заключение

Проведенный протеомный анализ сыворотки крови больных БА, имеющих в анамнезе указание на перина­тальное поражение ЦНС, выявил несколько дифферен­цированно выраженных белков по сравнению со здоро­выми детьми. Модификация продукции данных белков свидетельствует о наличии повреждений на молекуляр­ном уровне возникших, возможно, в перинатальном пе­риоде, приводящих к метаболическим и функциональ­ным нарушениям в организме больного, страдающего БА. А полученные в ходе данного исследования особен­ности протеомного спектра у детей с патологией брон­холегочной системы расширяют представления о моле­кулярных аспектах патогенеза БА, что обеспечит новые возможности для диагностики и терапии этого заболева­ния у детей.