Изучение состояния гипоксии почечной ткани у больных оксалатным уролитиазом

Введение

Оксидативный стресс является неотъемлемой частью многих патологических процессов, со­провождающихся гипоксией ткани [1][2][3][4][5][6].

В развитии воспалительного процесса главная роль принадлежит нейтрофилам, которые рассматриваются как источник свободных радикалов при многих заболе­ваниях [7][8][9][10][11].

В то же время классическим биохимическим реакци­ям с участием ключевых ферментов и метаболитов очень часто не уделяется должного внимания, что приводит очень часто к ложным выводам о роли того или иного метаболического звена в развитии патологического про­цесса.

Генетически обусловленные индивидуальные ре­акции организма изучаются фармакогенетикой. Её ос­новные концептуальные положения базируются на не­однократно упоминающихся в литературе принципах генетического разнообразия человека, связанных с на­личием генетического полиморфизма [12][13][14][15][16]. Можно говорить о своеобразном «дизайне» или «скелете» про­водимых исследований для получения информации о прогрессировании заболевания и ранней диагностики начальных форм той или иной патологии [17].

Изменение метаболизма в органах и тканях организ­ма тесно связано с генетическим полиморфизмом, кото­рый обусловливает напряжение биохимических реакций через усиление или ослабление синтеза соответствующих ферментов [12][13][14][15][16][17].

Цель исследования — определение вклада ключевых метаболитов и ферментов, с учетом полиморфизма по­следних, в развитие оксалатного уролитиаза.

Материалы и методы

В исследование включены 72 пациента, находивших­ся на обследовании и лечении в урологическом отделе­нии ГУЗ ОКБ г. Саратова в период с января по декабрь 2017 г. Пациенты в количестве 72 человек (30 мужчин и 42 женщины) вошли в группу с ранее подтвержденным оксалатным уролитиазом, 10 человек составили кон­трольную группу здоровых добровольцев (5 мужчин и 5 женщин). Возраст пациентов составил 51,7±13,4 лет (min-max: 38-70 лет), возраст добровольцев — 49,6± 11,2 лет (min-max: 35-60 лет). Дизайн исследования одо­брен Этической комиссией Саратовского государствен­ного медицинского университета им. В.И. Разумовского.

Группа больных с оксалатным уролитиазом набира­лась по следующим критериям включения: подтверж­денный диагноз оксалатный уролитиаз, согласно NKF Clinical Practice Guidelines for Chronic Kidney Disease, возраст от 38 до 70 лет. Диагноз подтверждался метода­ми обзорной и экскреторной урографии, компьютерной томографии с контрастированием, с определением плот­ности камней в единицах Хаунсфилда, а также обязатель­ного определения химического состава мочевых камней методом инфракрасной спектрометрии (обследование проводилось в частной лаборатории) в послеоперацион­ном периоде.

Группа здоровых лиц набиралась по следующим кри­териям включения: отсутствие в анамнезе оксалатного уролитиаза, возраст участников от 38 до 70 лет. Для под­тверждения диагноза проведено ультразвуковое иссле­дование почек, обзорная и экскреторная урография, при которой наличие конкрементов не обнаружено.

В ходе набора пациентов в группы учитывался также ряд критериев исключения участников из исследования: наличие в анамнезе сахарного диабета, онкологических заболеваний, трансплантации почки, стеноза почечных артерий, ревматоидного артрита, ВИЧ инфицированные пациенты, больные с синдромом приобретенного имму­нодефицита и прочими хроническими заболеваниями в стадии обострения.

Для целей исследования был осуществлен забор крови пациентов, предварительно все участники были поделены на группы. В I группу вошли больные с подтвержденным оксалатным уролитиазом, ранее проходившие лечение в условиях урологического отделения ОКБ, оператив­ное вмешательство не проводилось. II группу состави­ли пациенты с подтвержденным оксалатным уролитиазом, которым проводилось оперативное вмешательство (трансуретральная контактная уретеролитотрипсия) по поводу удаления камней различной локализации, сред­няя продолжительность оперативного лечения 30-60 мин. III группа — больные через сутки после оперативного лечения, IV группа — больные через 1 месяц после опе­ративного лечения. В группу контроля вошли здоровые добровольцы.

Определение молочной кислоты в сыворотке кро­ви. Проводили ферментативный колориметрический тест, используя реагенты от производителя «Biosub'LA».

Определение активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови. Проводили ферментативный колори­метрический тест, от производителя ЗАО «Диакон».

Определение содержания белковосвязанного окси- пролина (БСОП) в сыворотке крови [18].

Определение уровня гомоцистеина в сыворотке крови. Уровень гомоцистеина (ГЦ) определялся на ап­парате Immulite-2000 (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., США).

Метод определения малонового диальдегида с по­мощью тиобарбитуровой кислоты [19].

Метод определения активности глутатионперокси- дазы в цельной крови [20].

Исследование полиморфизмов генов. Выделе­ние ДНК из лейкоцитов по протоколу ‘Wizard”. (Genom­ic DNA Purification Kit A 112). Гибридизация с зондами на биочипе (методика ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН).

Статистические методы исследования. Использова­ли несколько статистических методов. Стандартный па­кет STATISTICA, версия 8.0. критерий Манна-Уитни (U), двусторонний точный тест Фишера (программа Graph- Pad InStat) [21].

Результаты

При развитии гипоксических явлений в тканях воз­можно непосредственное взаимодействие супероксида- нионрадикала с пролином с образованием оксипролина, предшественника глиоксиловой кислоты (прекурсора оксалата). При разрушении клеточных мембран усилива­ется поступление в клетки ионов кальция, которые могут непосредственно вступать во взаимодействие с оксалатом с образованием микрокристаллов. Следует также обратить внимание на факт превращения глутаминовой кислоты в оксипролин.

При сниженной активности глутатионпероксидазы (ГПО) и глутатионтрансферазы (GSTM 1 и GSTT 1 — делеция, нулевая аллель), глутатион может рас­падаться на аминокислоты (глутаминовая, глицин, цистеин) с последующей их трансформацией в конечные продукты метаболизма в условиях гипоксии тканей, а именно, глутаминовая кислота будет последователь­но трансформироваться в пирролин-5-карбоксилат (1.5.1.12-1 -пирролин-5-карбоксилат дегидрогеназа, Metabolic Pathways, Sigma, Product No.M3782, 1997), пролин (1.5.99.8-пролин гидрогеназа, 1.5.1.2-пирролин-5- карбоксилат редуктаза, Metabolic Pathways, Sigma, Product No.M3782, 1997), гидроксипролин (1.14.11.2.-проколлаген-пролин деоксигеназа, Metabolic Pathways, Sigma, Prod­uct No.M3782, 1997), 3-гидроксипирролин-5-карбоксилат (1.5.1.2.- пирролин-5-карбоксилат редуктаза, Metabolic Pathways, Sigma, Product No.M3782, 1997), 4-гидроксиглу- тамат (1.5.1.12.- 1- пирролин-5-карбоксилат дегидроге­наза, Metabolic Pathways, Sigma, Product No.M3782, 1997), 4-гидрокси-2-оксоглутарат (2.6.1.23-4-гидроксиглутамат трансаминаза, Metabolic Pathways, Sigma, Product No.M3782, 1997), пируват и глиоксилат (4-гидрокси-2- оксоглутарат альдолаза, Metabolic Pathways, Sigma, Prod­uct No.M3782, 1997), глицин — в глиоксиловую кислоту при участии ферментов (1.4.1.10-глициндегидрогеназы и 2.6.1.4-глицинтрансаминазы, Metabolic Pathways, Sigma, Product No.M3782, 1997), а цистеин — в гомоцистеин (Metabolic Pathways, Sigma, Product No.M3782, 1997), осо­бенно подобная ситуация будет усугубляться при поли­морфных вариантах гена MTHFR (677 С>Т, 1298 A>C), продукт которого принимает участие в метаболизме фо­латов. Гомоцистеин может активно участвовать в продук­ции свободных радикалов [22].

У больных мочекаменной болезнью полиморфизм гена MTHFR, отвечающего за метаболизм гомоцистеина, принимающего активное участие вместе с АТФ и пулом неорганического фосфата в целом как в формирова­нии метаболита S-аденозилметионина, участвующего в синтезе важнейших нейромедиаторов (дофамина, нора- дреналина) и гормонов (адреналина), так и в развитии перекисного окисления липидов, составил 55 % (С/С по­лиморфизм, то есть «дикий» тип составил 45 %, гетерози­готы С/Т составили 35 % и гомозиготы по рецессиву — Т/Т — были представлены 20 % от всего количества ис­следованных образцов, OR=2.97, Р < 0.05), при этом наи­больший процент полиморфных вариантов гена MTHFR приходился на больных с камнями, представленными оксалатами и фосфатами, а именно у больных с фосфатурией и оксалатурией обнаруживается 75 % полиморф­ных гетерозиготных ( С/Т ) вариантов гена MTHFR по сравнению с больными с оксалурией и почти 85 % по­лиморфных гомозиготных ( Т/Т ) вариантов гена MTH- FR по сравнению с больными с оксалурией, OR=3.14, Р < 0.05.

Таким образом, в проведенных исследованиях уста­новлены отличия в полиморфизме гена MTHFR, отвеча­ющего за метаболические превращения гомоцистеина в организме больных мочекаменной болезнью.

У больных мочекаменной болезнью с выраженной ок- салатурией выявляется полиморфизм гена GSTM1, отве­чающего за активность фермента глутатионтрансферазы. При анализе частот генотипов у пациентов с мочекамен­ной болезнью (МКБ) было выявлено увеличение часто­ты «нулевого» GSTM1 генотипа по сравнению с группой здоровых доноров (OR=1.80, Р < 0.05). Известно, что глутатионтрансфераза катализирует конъюгацию промежу­точных метаболитов с восстановленным глутатионом, включая и продукты ПОЛ, и работает как синергист глутатионпероксидазы.

Генетический полиморфизм GSTM1 составил около 30 % присутствия гетерозигот в популяции. Генетиче­ский полиморфизм GST^ составил около 20 % присут­ствия гетерозигот в популяции (OR=2.73, Р < 0.05).

При исследовании концентрации МДА у больных с различной степенью тяжести обнаружено изменение этих показателей в плазме крови (таблица 1).

При исследовании содержания МДА в плазме крови больных МКБ обращает на себя внимание тенденция увеличения концентрации этого показателя при про­ведении оперативного вмешательства в почках. МДА в момент операции был значительно выше по сравнению с контролем: 14,4±0,3 мкМ/л для МДА. Можно утверждать, что концентрация МДА является общим неспецифиче­ским показателем, который отражает выраженность и напряжение окислительных реакций организма в момент проведения оперативного вмешательства. На это указы­вает и двукратное увеличение МДА, наблюдавшееся в по­слеоперационном периоде в плазме крови больных раком мочевого пузыря [23].

Главными антиоксидантными ферментами являются каталаза и глутатионпероксидаза (ГПО), с помощью ко­торых катализируются реакции восстановления молекул перекиси водорода.

Результаты исследования активности ГПО приведены в табл. 2.

Обнаруживается достоверное снижение активности ГПО у больных МКБ во всех группах, что косвенно может указывать на недостаточную активность данного фер­мента, особенно в группах с делециями в генах GSTM1 и GST^ (данные не приводятся).

При исследовании концентрации лактата и актив­ности лактатдегидрогеназа (ЛДГ) у больных с различной степенью тяжести обнаружено изменение этих показате­лей в плазме крови (табл. 3).

При исследовании концентрации БСОП у больных с различной степенью тяжести обнаружено измене­ние этих показателей в сыворотке крови: наблюдается тенденция к их увеличению во всех группах пациентов (табл. 4).

Происходило изменение концентрации гомоцистеина в крови больных оксалатным уролитиазом (табл. 5).

Следует отметить, что повышение концентрации дан­ного метаболита обнаруживалось в основном у больных с полиморфизмом гена MTHFR как по гетерозиготному (С/Т), так и гомозиготному (Т/Т) профилю (данные не приводятся).

Обсуждение

Увеличение концентрации малонового диальдегида в плазме крови при развитии гипоксии указывает на усиле­ние АТФ в тканях, поврежденных воспалительным про­цессом.

Увеличение концентрации малонового диальдеги­да в плазме крови при развитии гипоксии указывает на процессы увеличения количества свободных радикалов в ткани. Метаболизм свободнорадикальных процессов объективно отражает ситуацию, связанную с уменьше­нием энергетического заряда клетки и, следовательно, с уменьшением образования АТФ в тканях, поврежденных воспалительным процессом.

В условиях гипоксии, скорее всего, происходит пере­нос электронов и протонов непосредственно на моле­кулярный кислород от восстановленных эквивалентов НАД•Н₂ и ФАД•Н₂ с образованием супероксиданиона и его последующего восстановления в перекись водорода.

Образовавшиеся свободнорадикальные частицы бу­дут взаимодействовать с жирными кислотами, которые входят в состав мембран клеток, в дальнейшем будут их окислять, что приведет к разрушению мембранных структур, включая митохондрии и лизосомы.

Деструкция митохондрий приведет к снижению вы­работки АТФ и увеличению концентрации свободного фосфата в цитозоле клеток, а разрушение лизосом — к выходу из них гидролаз, что будет способствовать ауто­лизу клеточных элементов и поддерживать воспалитель­ный процесс.

Распад клеточных мембран будет способствовать вхождению ионов кальция внутрь клеток и увеличению вероятности образования нерастворимых солей — оксалатов (конечный продукт метаболизма глицина, глу­таминовой кислоты и цистеина, метаболизм которого будет проходить через цистеин-сульфинат,1.13.11.20, ала- нин,4.1.1.12. пируват,2.6.1.2., Р-гидроксипируват,1.1.1.95., фосфосерин,2.6.1.52., серин,3.1.3.3, глицин, 2.1.2.1. Meta­bolic Pathways, Sigma, Product No.M3782, 1997) и фосфа­тов (свободный остаток Н₂РО₄^- в цитозоле).

В условиях гипоксии пируват будет трансформиро­ваться в лактат, концентрация которого будет нарастать в плазме крови, а гидроксипролин, концентрация которого увеличивается при повреждении почечной паренхимы, будет трансформироваться в глиоксилат с последующим преобразованием в оксалат. Необходимо подчеркнуть, что гидроксипролин может быть обнаружен в плазме крови и в моче не только как продукт распада коллаге­новых структур, повреждаемых почечными камнями, но и как продукт трансформации глутаминовой кислоты и непосредственного окисления пролина свободными ра­дикалами. Дефекты по белковым продуктам гена MTHFR (участвует в метаболизме фолатов и в образовании гомоцистеина) и генов GSTM1 (GSTH), GРО 1-3, ответ­ственных за перенос и метаболизм глутатиона, будут способствовать накоплению в тканях цистеина, глицина и глутамата, которые по своим метаболичекским путям будут превращаться в конечном итоге в гидроксипролин и глиоксиловую кислоту и, следовательно, в оксалат, ко­торый в данном конкретном случае будет выступать как своеобразное конечное «депо» вышеуказанных метабо­литов.

Заключение

Обнаружено увеличение концентрации МДА при проведении оперативного вмешательства в почках. МДА в момент операции был значительно выше, по сравне­нию с контролем, почти в 2 раза. Можно утверждать, что концентрация МДА является общим неспецифическим показателем, который отражает выраженность и напря­жение окислительных реакций организма в момент про­ведения оперативного вмешательства.

Снижение активности у больных ГПО в 2-2.2 раза во всех группах указывает на недостаточную активность данного фермента у больных мочекаменной болезнью.

Происходит увеличение активности ЛДГ и концен­трации лактата у больных с различной степенью тяжести в 1.5 и 2 раза соответственно.

Концентрация БСОП у больных с различной степе­нью тяжести увеличивалась в 2-3 раза по сравнению с контрольными значениями.

Увеличение концентрации гомоцистеина в крови больных оксалатным уролитиазом происходило в 2 раза по сравнению с контролем.

Таким образом, данные показатели могут быть пред­ставлены как маркеры гипоксии у больных мочекамен­ной болезнью, а маркеры гипоксии почечной ткани могут рассматриваться как патогенетическое звено в развитии оксалатного уролитиаза.

Исследование не имело спонсорской поддержки.

Авторы заявляют об отсутствия конфликта инте­ресов.