Новые критерии качества свежезамороженной плазмы

Введение

Прогресс современной хирургии, травматоло­гии, реаниматологии во многом определяется совершенствованием компонентной гемотрансфузионной терапии [1][2]. За последние несколько десятилетий клиническая практика переливания крови значительно изменилась. Потенциальный риск гемотрансмиссивных заболеваний привел к необходимости контроля производства безопасной и высококачествен­ной крови, охватывающего все аспекты - от сбора и пе­реработки до хранения крови. Строгий выбор доноров, идентификация патогенов, которые могут передаваться через кровь, и развитие технологий, которые могут по­высить качество крови, привели к существенному сниже­нию потенциальных рисков и осложнений, связанных с переливанием крови [3].

Плазма — важнейший компонент донорской крови. Приоритетной задачей трансфузиологии является со­хранение уникальных свойств свежезамороженной плаз­мы (СЗП), так как гемотрансфузии несут определенную опасность развития осложнений, связанных с модифи­кацией отдельных биологически активных систем крови в процессе ее хранения. Современные технологии заго­товки донорской крови, основанные на целенаправлен­ном получении отдельных компонентов крови (аферезе), молекулярном тестировании гемотрансмиссивных забо­леваний, лейкоредукции, инактивации патогенов, карантинизации плазмы направлены на обеспечение безопас­ности и сохранение биологических свойств донорской плазмы [4]. Нарушение процесса хранения и транспор­тировки цельной донорской крови являются основными причинами снижения функциональных свойств СЗП. Основные требования к обеспечению безопасности по стерильным условиям, проведению карантинизации, контролю гемотрансмиссивных инфекций в РФ изложе­ны в Постановлении Правительства РФ от 26.01.2010 г. № 29 «Об утверждении Технического регламента о требо­ваниях безопасности крови, ее продуктов, кровезамеща­ющих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии».

Одним из определяющих критериев качества заготав­ливаемых гемокомпонентов является здоровье донора. Однако врачу-трансфузиологу при первичном осмотре сложно объективно оценить соматический статус чело­века. Зачастую единственным лабораторным критерием допуска донора к кроводаче является содержание гемо­глобина.

Свежезамороженная плазма является источником факторов, нормализующих процессы свёртывания и антипротеазную активность крови. Именно эти свойства плазмы используются для лечения многих заболеваний, сопровождающихся патологическими изменениями си­стемы гемостаза [5].

Требования к показателям биологической полноцен­ности, функциональной активности и лечебной эффек­тивности свежезамороженной плазмы не отражают всего спектра уникальных характеристик плазмы как коррек­тора плазменно-коагуляционного гемостаза. При этом не определено, когда контролировать плазму — до, после замораживания или в процессе её хранения. Анализ мор­фологических, биохимических и других процессов, про­исходящих при длительном хранении СЗП при низких температурных режимах, стал особенно актуальным в связи внедрением в практику работы учреждений, заго­тавливающих донорскую кровь, требований приказа МЗ РФ от 07.05.2003 № 193 (в ред. приказов Минздравсоцразвития РФ от 21.02.2005 № 147, от 19.03 2010 №170) «О вне­дрении в практику работы службы крови в Российской Федерации метода карантинизации свежезамороженной плазмы».

Цель исследования — разработка новых критериев качества свежезамороженной плазмы.

Материалы и методы

Исследование проведено на базе Ростовского госу­дарственного медицинского университета. Группу иссле­дования составили 75 доноров. Доноры обследовались в соответствии с нормативными документами и были допущены к донациям. Первую группу составили 48 до­норов без предварительной подготовки к кроводаче. Во второй группе (27 человек) доноры получали биолан интраназально в дозе 3 мг 3 раза в день в течение 3-х дней до донации. Плазму крови доноров хранили в герметич­ных полимерных контейнерах фирмы ГринКросс (Ко­рея) с консервантом CPD (100 мл консерванта содержит: лимонную кислоту безводную — 0,327 г, цитрат натрия безводный — 2,63 г, бифосфат натрия водный — 0,222 г, декстрозу водную — 2,55 г, воду для инъекций q.s.). Кон­тейнеры с плазмой хранили при температуре -40⁰ С в биомедицинском холодильнике MDF-U-5411 (- 45С).

Для оптимизации подготовки доноров к кроводаче применяли «Биолан» (Регистрационное удостоверение № 001774.Р.643.06.2000). Биолан представляет собой ком­плекс пептидов, содержащих 7 незаменимых (гистидин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, триптофан, ва­лин) и 9 заменимых (аланин, аргинин, аспарагин, карнитин, цистеин, цистин, глутаминовая кислота, глутамин, глицин) аминокислот. Препарат обладает стабилизиру­ющим клеточный гомеостаз действием, антирадикаль- ными и мембрано-стабилизирующими свойствами. Из­учали влияние биолана на состояние ККС крови после 3-хдневного курса его приема у доноров и после 10, 20, 90 и 180 суток хранения свежезамороженной плазмы, за­готовленной от доноров, принимавших биолан.

Сбалансированностью системы протеазы-ингибиторы определяется уровень протеолитических процессов в свежезамороженной плазме. В связи с этим, проанали­зировано состояние протеаз и ингибиторов калликреин- кининовой системы в СЗП в процессе ее карантинизации. Определяли активность калликреина и содержание прекалликреина [10], общую аргинин-эстеразную активность [11], ингибиторную активность α₁-протеолитического ин­гибитора (α₁-ПИ) и α₂-макроглобулина (α₂-МГ) [12] в плаз­ме крови доноров в день донации. Последующие этапы исследования выполнялись через 10 и 20, 90 и 180 дней от начала хранения СЗП.

Статистический анализ проводили с использовани­ем общепринятых методов вариационной статистики и стандартного пакета прикладных программ STATISTICA. Статистически достоверными считали отличия, соответ­ствующие оценке ошибки вероятности р<0,05.

Результаты

Результаты исследования показали, что к 10-м суткам хранения свежезамороженной плазмы отмечается сниже­ние на 8,3 % (р_а<0,05) содержания прекалликреина (Фак­тора Флетчера), необходимого для сохранения реологиче­ских свойств крови (табл. 1).

К 10-м суткам хранения СЗП отмечено увеличение ак­тивности калликреина на 38,0 % (р_а<0,001), по сравнению с таковым у доноров. Несмотря на увеличение активности калликреина, суммарная активность трипсиноподобных протеиназ не изменилась. Необходимо отметить, что ин­гибиторная активность α₁-ПИ и α₂-МГ к 10-м суткам хра­нения СЗП также не изменилась.

К 20-м суткам хранения плазмы крови активность калликреина продолжает увеличиваться, превышая таковую у доноров на 114,2 % (р_а<0,001). Следствием интенсифи­кации калликреиногенеза является снижение на 37,7 % (р_а<0,001), по сравнению с таковым до начала хранения содержания прекалликреина (фактора Флетчера). Необхо­димо отметить, что калликреин играет центральную роль в регуляции активности протеолитических систем крови, ответственных за поддержание ее нормального агрегатно­го состояния.

К 20-м суткам хранения плазмы крови отмечено также снижение общей аргинин-эстеразной активности плазмы на 54,1 % (р_а<0,001) по сравнению с таковой при взятии крови. Отмечалось также снижение ингибиторной актив­ности α₁-протеиназного ингибитора и α₂-макроглобулина на 46,9 % (р <0,001) и 40,2% (р <0,001) соответственно.

Ослабление ингибиторного потенциала крови приводит, по-видимому, к активации калликреина.

Через 90 и 180 суток хранения СЗП не отменено из­менений изучаемых показателей ККС, по сравнению с та­ковым через 20 суток. Это позволяет сделать вывод о том, что уже на начальных этапах хранения СЗП происходят основные перестройки в системе протеазы-ингибиторы ККС.

У доноров приём биолана привел к уменьшению на 24,42 % (р_а<0,001) суммарной протеолитической активно­сти крови. Снижение протеолитического потенциала СЗП обеспечивает «сохранность» и других компонентов калликреин-кининовой системы крови в процессе карантинизации плазмы (табл. 2).

Так, через 10 суток хранения СЗП доноров, получав­ших биолан, не отмечено значимых изменений компонен­тов калликреин-кининовой системы крови. Только к 20-м суткам хранения СЗП отмечается некоторое снижение ак­тивности антипротеиназных систем плазмы крови за счёт наметившейся тенденции к уменьшению ингибиторной активности α₁-протеиназного ингибитора, остальные же компоненты ККС крови не отличались от таковых до нача­ла хранения плазмы. К 20-м суткам и на более поздних эта­пах хранения СЗП тенденция в изменении изучаемых по­казателей ККС не изменилась. Обращает на себя внимание снижение на 25,5 9% (р_а<0,05), по сравнению с таковым у доноров ингибиторной активности α₁-протеиназного ин­гибитора к 180-м суткам хранения СЗП.

Обсуждение

С целью усиления контроля за производством без­опасной и высококачественной крови перед трансфузи­ей пациенту донорская плазма подвергается процедуре карантинизации. Процесс карантинизации предполагает хранение СЗП в течение 6 месяцев при температуре ниже -30°С. Предполагается, что при карантинизации долж­ны сохраняться уникальные свойства плазмы крови [13]. Однако сохраняется вероятность развития у реципиента серьезных осложнений, несмотря на то что СЗП прохо­дит сложный многоэтапный анализ до и после каранти- низации. В связи этим разработка независимых методов анализа донорской плазмы и новых критериев оценки качества плазмы перед ее трансфузией пациенту является перспективной задачей трансфузиологии.

Результаты исследования показали, что к 10-м суткам хранения плазмы наблюдаются начальные фазы актива­ции ККС. Дисбаланс компонентов ККС крови к 20-м сут­кам увеличивается и сохраняется на более поздних этапах исследования (через 90 и 180 суток). В связи с тем что калликреин-кининовая система относится к системам «плавающих» гуморальных регуляторов, которые определяют адаптационные возможности организма при патологи­ческих состояниях разного генеза, дисбаланс в системе протеазы-ингибиторы ККС может повлиять на эффектив­ность переливания СЗП (рис. 1).

Увеличение активности калликреина приводит к акти­вации других протеолитических систем плазмы крови. На первый план в данных условиях выступает, по-видимому, превращение плазменного прекалликреина (белка-пред­шественника) в калликреин в так называемой «контакт­ной системе активации» за счет появления при замора­живании плазмы крови анионных «полей» [7]. Этот вывод подтверждается снижением содержания прекалликреина в СЗП через 20 суток хранения. Необходимо отметить, что «контактная система активации» рассматривается как триггерный механизм, запускающий активацию всех пяти протеолитических систем плазмы крови: калликреин-кининовую и ренин-ангиотензиновую системы, гемокоагу­ляцию, фибринолиз, комплемент. Активации протеолиза в процессе карантинизации плазмы крови способствует угнетение ингибиторной активности α₁-ПИ и α₂-МГ.

Следствием активации протелитических процессов в СЗП при ее хранении является смещение в сторону поло­жительных значений редокс-потенциала крови, что свидетельствует об её окислении [14]. Вероятно, активация протеолиза в СЗП в процессе ее хранения увеличивает доступность белков для их окислительной модификации.

Несмотря на достижения современной медицины, сохраняется необходимость применения аллогенной донорской крови. Это требует, с одной стороны, совершен­ствования методов хранения СЗП, с другой разработки информативных критериев оценки качества гемокомпо­нентов. Необходимо отметить, что требованиями Совета Европы регламентирован контроль активаторов прекалликреина в свежезамороженной плазме, который России не предусмотрен.

Перспективным направлением подготовки доноров к кроводаче крови является предварительное введение до­норам препаратов, способных влиять на состояние клю­чевых гомеостатических систем организма. В последнее время достигнуты значительные успехи в изучении меха­низмов регуляции физиологического гомеостаза, которые стали основой для разработки нового класса лекарствен­ных препаратов, функционально и химически соответ­ствующих естественным эндогенным биорегуляторам. К таким препаратам принадлежат адаптогены, перспек­тивный класс биологически активных веществ, способ­ных повышать адаптивные возможности организма в условиях стресса. Использование адаптогенов приводит к адаптивной перестройке метаболизма, повышая сопро­тивляемость организма к различным факторам внутрен­ней и внешней среды. В связи с этим, с целью повышения качества переливаемых компонентов крови, у доноров необходимо проводить индивидуальную оценку адаптив­но-компенсаторных возможностей организма и с учетом выявленных особенностей, проводить подготовку к кроводаче.

Анализ результатов исследования показал, что в плаз­ме крови доноров, получавших биолан, в процессе ка- рантинизации не отмечено интенсификации протеолитических процессов, а суммарная активность сериновых протеаз снижается (рис. 1). Одним из возможных механиз­мов действия биолана является ингибирующее влияние на сериновые протеазы крови аминокислот, входящих в со­став биолана. Таким образом, подготовка доноров к кро- водаче с применением адаптогенов позволяет обеспечить сохранность СЗП в процессе карантинизации.

Анализ компонентов калликреин-кининовой системы крови может быть использован как дополнительный неза­висимый метод анализа донорской плазмы перед ее транс­фузией пациенту.

Заключение

Результаты исследования показали, что «преадаптация» доноров перед кроводачей с применением адаптогенов позволяет минимизировать риск снижения качества свежезамороженной плазмы крови в процессе карантинизации. Под действием биолана снижается протеолитический потенциал крови, что увеличивает сохранность корректоров плазменно-коагуляционного гемостаза. Анализ показателей калликреин-кининовой системы крови может быть использован как дополнительный критерий качества свежезамороженной плазмы перед проведением процеду­ры трансфузии.