Молекулярно-эпидемиологические и клинические аспекты энтеровирусной инфекции на юге России

Введение

Начало XXI в. ознаменовалось появлением угрозы глобального распространения ряда инфекций, вызываемых РНК-содержащими вирусами. Среди них так называемые атипичная пневмония, птичий грипп, энтеровирусная инфекция, новая коронавирусная инфекция. Все они взяты под контроль ВОЗ. Эти инфекции можно условно отнести к «новым», так как их изучение сопровождалось открытием вирусных агентов или выявлением неизвестных свойств возбудителя и чрезвычайно широким общественным резонансом.

ЭВИ характеризуется повсеместным распространением, обилием серотипов (генотипов) возбудителя, пантропизмом энтеровирусов и манифестацией данной инфекции в виде различных клинических вариантов с поражением одного или нескольких органов и систем, массовостью заболевания, многообразием механизмов заражения и путей передачи инфекции, широким носительством, высокой восприимчивостью к инфекции (особенно в детском возрасте), обнаруженной в последние годы связью между ЭВИ и диабетом 1-го типа, многочисленными случаями коинфекции ЭВИ у больных коронавирусной инфекцией, вызванной SARS-CoV-2, а также высокой летальностью [1–7].

В последние годы происходит эволюция энтеровирусных инфекций. Выявляются новые типы энтеровирусов, имеющие клиническое значение. В настоящее время энтеровирусы человека представлены более чем 120 генетически гетерогенными серотипами [8]. Множество типов неполиомиелитных энтеровирусов (НПЭВ), постоянно меняющиеся масштабы их распространения и спектр эпидемически значимых серотипов и генетических вариантов, доминирующих в определённое время в конкретном географическом районе, обусловливают актуальность постоянного слежения за циркуляцией энтеровирусов (ЭВ) среди населения с использованием молекулярно-генетических технологий [5].

География ЭВИ широка и охватывает практически все страны мира [9][10]. Эндемичными районами с высокой заболеваемостью ЭВИ по-прежнему остаются страны Азиатско-Тихоокеанского региона [9][11]. Наиболее крупные из описанных исследователями вспышек, вызванных преимущественно вирусами ЕСНО 6,13,30, а также энтеровирусом 71 типа, имели место в Китае, на Тайване, Тунисе. В 2008 г. зарегистрирована крупнейшая вспышка ЭВИ в Китае с вовлечением в эпидемический процесс 19 административных образований страны и числом заболевших более 30 тыс. человек с 39 летальными исходами.  

В Российской Федерации официальная статистическая отчётность по ЭВИ введена с 2006 г. Вспышки и случаи ЭВИ регистрировались на территориях СЗФО, ЮФО, ПФО и СКФО [12–15]. Высокие цифры заболеваемости данной инфекцией характерны для территорий Дальневосточного федерального округа [16][17]. Эпидемиологические расследования этиологии вспышек ЭВИ в ряде случаев выявили наличие фактов заноса на исследуемых территориях энтеровирусов новых генотипов [18–20].

Изучение геновариантов энтеровирусов и создание банка данных важны для оценки динамики известных и новых изолятов, циркулирующих на территории Российской Федерации и характеризующихся разной способностью к распространению, патогенностью, антигенностью, а также для разработки адекватных мер профилактики, схем лечения, методов и средств диагностики.

Цель исследования — изучение молекулярно-эпидемиологических и клинических аспектов энтеровирусной инфекции в Ростовской области за период 2006–2020 гг. для совершенствования системы эпидемиологического надзора за данным заболеванием.

Материалы и методы

Сбор материала проводился на территории Ростовской области. Объектами исследования являлись больные энтеровирусной инфекцией (12425 чел.), контактные лица (974 чел.), больные острыми кишечными инфекциями (200 чел.) и другими заболеваниями (3694 чел.); пробы объектов окружающей среды: сточные воды канализации — 2336 обр., вода поверхностных водоемов — 259 обр., питьевая вода — 51 обр., продукты питания — 64 обр.; штаммы энтеровирусов в количестве 142 экз. для определения их генотипа.

В работе использованы следующие методы: эпидемиологический, вирусологический (реакция нейтрализации), молекулярно-биологический (ПЦР, секвенирование, филогенетический анализ), микробиологический (традиционный, с применением бактериологического анализатора Vitek-2, масс-спектрометрический MALDI-TOF), статистический с использованием программ SPSS Statistics Base 22,0; Microsoft Office Excel 2016.

Материалом для микробиологических и молекулярно-биологических исследований являлись фекалии и мазки из зева. Применяли метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real time) с использованием тест-систем «АмплиСенс® Enterovirus-FL» и «АмплиСенс® Enterovirus 71-FL» в соответствии с инструкциями производителя.

Для определения генотипов циркулирующих штаммов энтеровирусов осуществлялось фрагментное секвенирование нуклеотидных последовательностей РНК штаммов вирусов, выделенных из положительных в ПЦР образцов, по Сэнгеру [21]. Молекулярное типирование энтеровирусов основывалось на ОТ-ПЦР и определении нуклеотидной последовательности в области генома по 5' UТR (5' НТР) области РНК ЭВ с помощью специфических праймеров. Генотип ЭВ определяли сравнением полученной последовательности с имеющимися в банке генетических последовательностей GenBank (NCBI) последовательностями прототипных энтеровирусов человека при помощи программы «BLAST».

Ретроспективный анализ эпидемиологической ситуации по ЭВИ в Ростовской области осуществляли с использованием карт эпидемиологического обследования очагов и статистических отчетных данных, клинической картины заболевания — с использованием стационарных и амбулаторных карт больных с установленным диагнозом.

Результаты

С 2006 г. (начало официальной регистрации ЭВИ в Российской Федерации) по 2012 г. заболеваемость в области носила спорадический характер с регистрацией от 1 до 38 случаев в год (от 0,02 до 3,8 на 100 тыс. населения). Годовые показатели заболеваемости в указанный период были в 3,8–6,2 раза ниже общероссийских. Мониторинг циркуляции энтеровирусов в окружающей среде (сточные воды) свидетельствовал о том, что в период с 2006 по 2012 гг. вирусный пейзаж был весьма разнообразен и менялся практически ежегодно (табл. 1).

Приведённые в таблице результаты свидетельствуют о том, что в г. Ростове-на-Дону за период 2006–2012 гг. в окружающей среде регистрировались только энтеровирусы, относящиеся к ЕСНО и Коксаки. Такие же энтеровирусы выделяли и в материале от больных: в 2008 г. — ЕСНО 30, в 2009 г. — ЕСНО 5, ЕСНО 6, в 2010 г. — ЕСНО 6, в 2011 г. — ЕСНО 17, Коксаки А6, в 2012 г. — ЕСНО 6, ЕСНО 7, Коксаки В3 и В4.

В 2013 г. в Ростовской области зарегистрирован эпидемический подъём заболеваемости ЭВИ с формированием локальных очагов в дошкольных образовательных учреждениях, обусловленный появлением энтеровируса 71 типа субгенотипа С4, который ранее на территории области не выделяли. Появление нового генетического варианта возбудителя ЭВИ привело к резкому подъёму заболеваемости, а отсутствие иммунитета у населения способствовало массовому и быстрому распространению инфекции. За период эпидемического неблагополучия в 2013 г. было зарегистрировано 622 случая ЭВИ (14,6 на 100 тыс. населения) с вовлечением в эпидемический процесс разных возрастных, социальных групп населения, возникновением локальных вспышек и групповых заболеваний (рис. 1).

В конце мая 2013 г. в одном из организованных коллективов Первомайского района г. Ростова-на-Дону, в МБДОУ № 83 (детский сад «Теремок») была зарегистрирована вспышка острых респираторных вирусных и острых кишечных инфекций (ОРВИ и ОКИ).

Первый случай заболевания отмечен 28.05.2013 г. в младшей группе. Всего заболело в данном дошкольном учреждении 78 детей, из них ЭВИ — 53 человека, энтеровирусным менингитом (ЭВМ) — 25 человек. Один ребенок в возрасте 3 лет с симптомами менингоэнцефалита умер 02.06.2013 г. По результатам посмертного вирусологического и бактериологического исследования биологического материала установлено, что его смерть наступила от микст-инфекции — энтеровирусной и пневмококковой этиологии на фоне персистирования цитомегаловируса. Ребенок состоял на диспансерном учёте в группе часто болеющих детей.

Второй ребенок с менингеальным синдромом из этой же группы детского сада поступил в реанимационное отделение 03.06.2013 г. На следующий день, 04.06.2013 г., бригадой врачей был организован осмотр всех детей — 270 человек, посещающих МБДОУ № 83. Были активно выявлены и госпитализированы в инфекционные отделения 9 детей с высокой температурой и катаральными явлениями.

Возрастной состав заболевших детей варьировался от 1 года до 7 лет с преимущественной структурой 1–2 года (14 человек) и 3–6 лет (63 человека). Распределение по возрасту заболевших в 2013 г. детей МБДОУ № 83 совпадает с общепринятыми представлениями о наиболее уязвимых для ЭВИ возрастных группах.

Клиническая характеристика энтеровирусной инфекции у детей, обусловленной энтеровирусом 71 типа субгенотипа С4 представлена на рисунке 2.

Анализ динамики симптомов заболевания показал, что инфекционный процесс характеризовался двухфазным течением. В первую фазу ведущими являлись общеинфекционный, катаральный, ящуроподобный и лимфопролиферативный синдромы. Особенность второй фазы — присоединение симптоматики поражения ЦНС.

Несмотря на то, что у большинства пациентов ЭВИ протекала в среднетяжёлой форме, у 1/3 из них развилась патология ЦНС (менингит, менингоэнцефалит), ромбовидной ямки (ромбоэнцефалит) и/или мозжечка. Все дети имели отягощённый преморбидный фон и относились к группам риска в различных периодах: антенатальном, новорождённости, в возрасте старше одного месяца.

При проведении лабораторных исследований биологического материала были получены следующие результаты: из 156 заболевших воспитанников детского сада диагноз «ЭВИ» был установлен у 78 человек, лабораторно подтверждён — в 59 случаях. РНК ЭВ обнаружена в фекалиях у 53 заболевших, в мазках из зева — у 23 человек. У 24 детей определён ЭВ 71 типа.

При проведении эпидемиологического расследования было выявлено, что детский сад № 83 расположен в спальном микрорайоне г. Ростова-на-Дону рядом с вещевым рынком «Темерник», где работают часто выезжающие за пределы России мигранты, дети которых посещали указанное детское учреждение.

Одновременно проводили исследования по выделению патогенных бактерий и вирусов из объектов окружающей среды (50 проб питьевой воды и воды канализационных стоков). РНК ЭВ обнаружена в 2 пробах сточных вод: из канализационного коллектора, куда отводят сточные воды детского сада и жилых домов, где проживали заболевшие жители, и из канализационного коллектора, в который сбрасывают сточные воды детского инфекционного отделения № 6 МБУЗ «Городская больница №1 им. Н.А. Семашко», куда были госпитализированы больные ЭВИ дети.

Наличие энтеровируса в фекалиях, материале из зева носителей и больных с характерной клинической картиной (поражение ротоглотки и верхних дыхательных путей, рук) свидетельствует о реализации фекально-орального и аспирационного механизмов передачи возбудителя.

Помимо МБДОУ № 83 случаи с предварительным диагнозом «Энтеровирусная инфекция» были зарегистрированы одновременно в период с 28.05 по 10.06.2013 г. ещё в 11 дошкольных учреждениях, расположенных в Первомайском (5), Ворошиловском (2), Пролетарском (2), Советском (1) районах г. Ростова-на-Дону, а также в городах Ростовской области (Таганрог, Батайск, Азов). Во всех учреждениях эпидемиологическими особенностями ЭВИ были более раннее начало эпидсезона, массовость, быстрота развития эпидемического процесса с поражением преимущественно детского организованного контингента (2–6 лет) и клинической картиной, характерной для респираторных вирусных или бактериальных инфекций, сопровождающихся менингитами. 

Для определения генотипа возбудителя ЭВИ и установления эпидемиологических связей между сформированными очагами в Ростовской области было проведено в ФБУН «Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии» Роспотребнадзора фрагментное секвенирование образцов биологического материала от больных и носителей ЭВИ, протестированных методом ОТ-ПЦР с положительным результатом [22].

Результаты секвенирования показали, что среди исследованных 74 штаммов энтеровирусов человека наибольшее количество (48 штаммов или 64,9%) было определено как энтеровирусы человека вида А 71 типа, 9 штаммов (12,2%) были определены как энтеровирусы человека вида А Коксаки А16. В качестве редко встречающихся генотипов энтеровирусов человека зарегистрированы 5 штаммов (6,8%) энтеровируса человека вида А Коксаки А6, 4 штамма энтеровируса человека вида B ЕСНО 30 (5,4%), 2 штамма (2,7%) энтеровируса человека вида В ЕСНО 11, 2 штамма (2,7%) энтеровируса человека вида В Коксаки В5 и по одному штамму (по 1,4%) энтеровируса человека вида В ЕСНО 9, энтеровируса человека вида А Коксаки А4, энтровируса человека вида В Коксаки В 3, а также энтеровируса человека вида С Коксаки А 24. (Рис.3)

В результате филогенетического анализа были выявлены 4 обособленные группы вирусов. Три из них (46 штаммов) представлены нуклеотидными последовательностями РНК энтеровирусов 71 типа, выделенных от лиц из г. Ростова-на-Дону и г. Аксая и значительно отличающихся друг от друга по генетическим характеристикам. Четвёртая группа (7 штаммов) представлена нуклеотидными последовательностями РНК энтеровирусов, которые были выделены от лиц, проживающих в г. Таганроге. Данная группа штаммов имела высокий уровень соответствия генетических свойств со штаммами энтеровирусов, охарактеризованными в международной базе данных как энтеровирусы человека вида А Коксаки А16, выделенными в 2013 г. на территории Китая [23].

Выявление трёх групп энтеровирусов человека вида А 71 типа с высокой степенью генетического сходства нуклеотидных последовательностей РНК в каждой из них, при значительных различиях генетических характеристик между группами, а также группы близких по генетическим характеристикам энтеровирусов человека вида А Коксаки А16 позволяет предположить формирование условий для распространения инфекции как минимум в четырёх очагах ЭВИ, не связанных между собой.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей РНК, выделенных из штаммов энтеровирусов от больных и вирусоносителей в Ростовской области в период эпидемического подъема ЭВИ в 2013 г., показал, что штаммы энтеровирусов 71 типа, циркулирующие в Ростовской области, имели высокое генетическое родство со штаммами «китайского» происхождения 2008–2011гг., которые имели преимущественно субгенотип 4С. По-видимому, штамм был занесен в Россию из Китая за 2–3 года до эпидемического подъёма ЭВИ в Ростовской области и других территориях Юга России и циркулировал, не вызывая клинически регистрируемой заболеваемости [23][24].

Пейзаж энтеровирусов, выделенных из объектов окружающей среды в Ростовской области в 2013 г., представлен ЭВ 71 типа, Коксаки А24, ЕСНО11,23,30, то есть 5 генотипами.

В последующие годы (после вспышки заболеваемости ЭВИ в 2013 г.) регистрировались единичные случаи спорадической заболеваемости ЭВИ. В 2014, 2015 и в 2018 гг. показатель заболеваемости ЭВИ в Ростовской области находился на одном уровне, составляя 3,8 на 100 тыс. населения, что в 3,8 раза меньше такового в 2013 г. (рис. 1). С 2016 г. имела место тенденция к росту заболеваемости с 5,0 до 7,3 на 100 тыс. населения. В 2019 г. уровень заболеваемости ЭВИ достиг 8,5, а к 2020 г. снизился до 0,27 на 100 тыс. населения, что, по-видимому, было связано с введёнными антиковидными ограничениями. Максимальное количество случаев ЭВИ зарегистрировано в 2013, 2017 и в 2019 гг., что обусловлено циркуляцией новых для территории области вариантов энтеровируса.

Среди заболевших удельный вес детей колебался от 21% в 2009 г. до 94% в 2013 г.

Энтеровирусные менингиты составляли от 3,7% от общего количества случаев ЭВИ в 2014 г. до 35,7% в 2010 г. В клиническом аспекте во все годы наблюдения, кроме 2013 г., преобладали «малые» формы ЭВИ по типу герпангины, ящуроподобного синдрома, ОРВИ.

Заболеваемость ЭВИ в Ростовской области регистрировалась за анализируемый период на 33 территориях: 12 городах и 21 районе.

При анализе внутригодовой динамики ЭВИ за многолетний период установлена чётко выраженная летне-осенняя сезонность с началом подъема в июне-июле, пиком в августе и спадом в сентябре-октябре, что связано с природно-климатическими условиями на Юге России и периодом массового купания населения в водоёмах.  

В пейзаже энтеровирусов, выделенных от больных и носителей ЭВИ в Ростовской области в период 2014–2020 гг., преобладали ЭВ Коксаки А (1, 2, 4, 5, 6, 9, 10, 16) и Коксаки В (2,5) — более 48%, а также энтеровирусы ЕСНО (6, 9, 30) — в пределах 46%. Роль ЭВ 71 типа в патологии ЭВИ в указанный период была незначительной (около 6%).

Обсуждение

Представленные особенности клинического течения ЭВИ у детей в период вспышки данного заболевания в Ростовской области имели явное сходство с клиническим течением ЭВИ, вызванным энтеровирусом 71 типа: своеобразная цикличность, характеризующаяся первоначальным появлением ящуроподобного синдрома «руки-ноги-рот» с последующим развитием у части пациентов патологии ЦНС: менингита, энцефалита и ромбоэнцефалита [25][26]. У всех детей, заболевших в период эпидемического подъема ЭВИ, диагностирована, согласно классификации В.Ф. Учайкина (2002 г.), комбинированная форма ЭВИ-71, в том числе без поражения ЦНС — у 87 детей (62,6%), с поражением ЦНС — у 52 человек (37,4%). Патология ЦНС была обусловлена менингитом у 42 (32,0%) и менингоэнцефалитом — у 10 больных (7,2%) [4][22].

По данным филогенетического анализа, выделенные в 2013 г. в Ростовской области ЭВ человека вида А 71 типа имели высокий уровень соответствия генетических свойств со штаммами ЭВ, выделенными в 2008–2011 гг. на территории Китая. Этому могли способствовать активизация миграционных потоков из стран Азиатско-Тихоокеанского региона в Россию и наоборот [9]. Так, по данным Росстата, в 2012 г. в сравнении с 2011 г. туристический поток из Китая в Россию возрос на 47%, а всего за 5 лет с 2011 по 2015 гг. турпоток из Китая в нашу страну возрос с 233 тыс. до 1,3 млн человек, то есть в 5,6 раза.

Осложнение эпидситуации по ЭВИ в южных субъектах Российской Федерации в 2013 году связано с циркуляцией высокопатогенного ЭВ 71 типа, который до 2013 г. не встречался на юге России, что определило его высокое эпидемиологическое значение и послужило фактором его широкого распространения. Это свидетельствует о значимости в развитии эпидпроцесса ЭВИ инфекционно-иммунологических взаимоотношений между возбудителем и состоянием иммунологической невосприимчивости к нему у населения, особенно детского возраста. По нашему мнению, этот факт согласуется с теорией саморегуляции паразитарных систем, разработанной академиком АМН СССР В.Д. Беляковым [27–29]. В основе этой теории лежит понятие о неоднородности популяции возбудителя по вирулентности и антигенности, а также гетерогенность населения по иммунитету. В ходе эпидемического процесса меняются степень и характер неоднородности популяции возбудителя, что происходит в соответствии с изменением коллективного иммунитета населения.

Выводы

1. На протяжении 2006–2020 гг. течение эпидемического процесса энтеровирусной инфекции в Ростовской области характеризовалось спорадической заболеваемостью с некоторыми колебаниями показателей заболеваемости по годам от 0,02 до 14,6 на 100 тыс. населения. При анализе внутригодового распределения случаев ЭВИ за многолетний период установлена четко выраженная летне-осенняя сезонность, что связано с природно-климатическими условиями на юге России и периодом массового купания населения в водоемах.
2. Зарегистрированный подъём заболеваемости ЭВИ в 2013 г. с формированием локальных очагов в организованных детских коллективах с количеством заболевших 622 человека и одним летальным исходом был обусловлен появлением и распространением нового, ранее не регистрировавшегося в Ростовской области энтеровируса человека 71 типа, одного из наиболее патогенных генотипов энтеровирусов.
3. По данным молекулярно-генетических исследований и филогенетического анализа, ЭВ 71 типа субгенотипа С4, вызвавший вспышку ЭВИ в Ростовской области, был близкородственным штамму, изученному в Китае в 2008–2011 гг. и завезенному в Российскую Федерацию в результате миграционных процессов. За период с 2006 по 2020 гг. по результатам секвенирования проб биологического материала от больных и вирусоносителей в Ростовской области выявлялись энтеровирусы 22-х типов: Коксаки А1,2,4,5,6,9,10,16; Коксаки В1,2,3,4,5; ЕСНО 5,6,7,9,11,12,17,30; энтеровирус А 71 типа субгенотипа С4.
4. Клиническое течение ЭВИ в период вспышки заболевания в 2013 г. у подавляющего большинства детей (94,9%) характеризовалось острым началом, развитием интоксикационного синдрома, своеобразной цикличностью с первоначальным появлением ящуроподобного синдрома с последующим развитием у части пациентов (37,4%) патологии ЦНС (менингит — 32,0%, менингоэнцефалит — 7,2%). Все дети, подлежащие обследованию, имели отягощённый преморбидный фон и относились к группам риска.
5. Оптимизация системы эпидемиологического надзора за ЭВИ в Ростовской области привела к снижению уровня заболеваемости ЭВИ с 14,5 в 2013 г. до 0,27 на 100 тыс. населения в 2020 г.