Органические кислоты в оценке клеточной митохондриальной функции при неразвивающейся беременности

Введение

Среди важнейших проблем практического акушерства одно из первых мест занимает невынашивание беременности, частота которого составляет 20%. [1]. Практически теряется каждая 5-я беременность, и это не имеет тенденции к снижению, несмотря на многочисленные и высокоэффективные методы диагностики и лечения, разработанные в последние годы [2][3]. Поистине «проблемой века» следует считать неразвивающуюся беременность (НБ). Международная федерация акушеров-гинекологов (FIGO) в 2006 г. объявила НБ современной эпидемией. В настоящее время нет единого предиктора к развитию НБ. У 40–50% беременных точная причина НБ не установлена [4].

Не вызывает сомнений, что в основе НБ лежит дисфункция эндометрия. Именно способность эндометрия адекватно реагировать на циклические колебания уровня стероидных гормонов крови приводит к формированию необходимых ультраструктурных изменений в эндометрии для возникновения «окна имплантации» и в конечном результате обеспечивает имплантацию оплодотворенной яйцеклетки, наступление и развитие беременности [2][5].

Существует множество доказательств, свидетельствующих о том, что патогенез ранних репродуктивных потерь тесно связан с окислительным стрессом (ОС), изменениями протеомного спектра, нарушением липидного обмена, снижением активности ферментов дыхательной цепи, возникающими в митохондриях [6][7]. И хотя патофизиология, лежащая в основе осложнений гестации, различна, изменения в структуре и функциях митохондрий являются во всех случаях общей терминальной стадией гибели клеток и могут быть мишенью для фармакотерапии.

Являясь неотъемлемой частью системной биологии, метаболомика обладает многочисленными преимуществами по сравнению с традиционными лабораторными исследованиями, изучение органических кислот (ОК) приобретает всё больший научный интерес, поскольку ОК являются важными компонентами метаболизма и играют особо важную роль в выработке клеточной энергии. ОК в основном отражают функционирование митохондрий и окисление жирных кислот, которое происходит в процессе дыхания клетки.

Цель исследования — определить прогностическую значимость низкомолекулярных метаболитов в патогенезе неразвивающейся беременности.

Материалы и методы

В исследование были включены 100 женщин репродуктивного возраста, из них 79 — с диагностированной при УЗИ неразвивающейся беременностью и 21 — с прогрессирующей беременностью, поступивших на артифициальный аборт. Критериями включения были репродуктивный возраста, неразвивающаяся беременность, подтверждённая при УЗИ. Критериями исключения стали пороки развития органов малого таза, антифосфолипидный синдром (АФС), системные заболевания.

Произведены иммуногистохимические исследования эндометрия и определение органических кислот в сыворотке крови и эндометрии методом ВЭЖХ. Проанализированы статистически значимые органические кислоты в сыворотке крови и эндометрии, связанные с нарушениями обмена жирных кислот, аминокислот, а также являющиеся промежуточными метаболитами в цикле Кребса.

Статистический анализ полученных данных выполнен с помощью пакета модулей STATISTICA® for Windows, Release 6.0 компании StatSoft®Inc., США (2003), серийный номер AXAR802D898511FA.

Результаты

Клинико-статистический анализ подтвердил сопоставимость групп по возрасту, социальному положению, соматическим и гинекологическим заболеваниям. Диагноз НБ при поступлении устанавливался на основании результатов ультразвукового исследования (отсутствие эмбриона при размерах плодного яйца 25 мм и более при трансабдоминальном сканировании и 18 мм и более при трансвагинальном сканировании, отсутствие сердцебиения эмбриона с копчико-теменным размером 5 мм и более).

Средний возраст пациенток с НБ в момент обследования составил 29,8±5,8 лет, четверть из них находилась в позднем репродуктивном возрасте (старше 35 лет).

Нами были проанализированы уровни 11 низкомолекулярных метаболитов в сыворотке крови и эндометрии, являющиеся субстратами цикла Кребса и b-окисления жирных кислот, играющие важную роль в выработке клеточной энергии. Из 11 изученных ОК гликолевая и адипиновая не имели статистически значимых различий между группами. Уровень гликолевой кислоты при НБ составил 5,8±4,8 ммоль/л, а при прогрессирующей беременности — 4,8±3,2 ммоль/л (р=0,102), адипиновой — 0,10±0,3 ммоль/л и 0,24±0,5 ммоль/л соответственно (р=0,101). Статистически значимые различия были выявлены при определении уровней молочной, пировиноградной, гиппуровой, гидроксифенилмолочной, 4-гидроксифенилуксусной и 4-гидроксифенилпировиноградной кислот в сыворотке крови (табл. 1).

Были определены 3 метаболита, которые определились только у женщин с НБ в сыворотке крови, такие как глутаровая, 4-гидроксифенилуксусная и гомогентизиновая кислоты в сыворотке крови (табл. 2).

При исследовании метаболитов в эндометрии достоверно значимые различия также имели молочная и пировиноградная кислоты (табл. 3).

4-гидроксифенилуксусная и метилмалоновая кислоты определились только у женщин с НБ (табл. 4).

При гистологическом исследовании эндометрия отмечались регрессивные изменения в сочетании с диффузной и очаговой лимфогистиоцитарной инфильтрацией (96,2%) с примесью плазматических клеток, а в отдельных случаях с образованием лимфоидных фолликулов, имелись также небольшие очаги склероза стромы (рис. 1 а, б) со склерозированными сосудами (89,9%) и венозным полнокровием с выраженными тромбозами (68,3%).

При иммуногистохимическом исследовании была установлена высокая экспрессия маркеров хронического эндометрита HLA-DR, CD 16 и CD 20 в строме эндометрия и снижение экспрессии VEGF и LIF (маркера рецептивности) в эпителии и строме. Нами была выявлена прямая корреляция между экспрессией VEGF и содержанием 4-гидроксифенилуксусной (r=0,411) и CD16 и молочной кислотой в эндометрии (r=0,523).

Обсуждение

Сопоставив, полученные результаты, мы выявили статистически значимые различия при определении молочной, пировиноградной и 4-гидроксифенилуксусной кислот в сыворотке крови и эндометрии между исследуемыми группами.

Молочная кислота (лактат) является ранним индикатором неадекватной перфузии клеток O₂ и используется в качестве «количественной» оценки тканевой гипоксии. Повышенный уровень лактата у женщин с НБ в сравнении с группой контроля (р=0,05) может указывать на сниженную оксигенацию тканей, ишемию и снижение митохондриальной функции. На образование клеточного лактата влияет «окислительно-восстановительное состояние» клетки, одной из таких клеточных окислительно-восстановительных реакций является равновесие между пировиноградной кислотой (пируватом) и лактатом. В норме соотношение лактат/пируват 10:1. Сдвиг соотношения лактат/пируват ингибирует образование митохондриального АТФ и ведёт к сдвигу цитоплазматического окислительно-восстановительного состояния клетки: НАДН накапливается, а НАД+ падает, что вызывает окислительный стресс (ОС).

4-гидроксифенилуксусная кислота является промежуточным метаболитом в процессе катаболизма аминокислоты тирозина, которая путём переаминирования с a-кетоглутаровой кислотой расщепляется на 4-гидроксифенилуксусную, гиппуровую, гидроксифенилмолочную и 4-гидроксифенилпировиноградную кислоты, далее 4-гидроксифенилуксусная окисляется в гомогентизиновую кислоту, последняя же окисляется до фумарилацетоацетата, с последующим превращением в фумарат и ацетат и выделением воды и углекислого газа. Поэтому определение гомогентизиновой и 4-гидроксифенилуксусной кислот у женщин с НБ может свидетельствовать о нарушении метаболизма тирозина, что может быть следствием повышенного расхода белка и гидроксилированием фенилаланина. Нарушение метаболизма тирозина может быть фактором риска инсулинорезистентности и снижения выработки гормонов щитовидной железы [6].

Выявленные изменения на молекулярном уровне высоко коррелировали с гистологическими и иммуногистохимическими изменениями в эндометрии у женщин с НБ.

Заключение

Таким образом, в основе патогенеза НБ лежит универсальный механизм патологических процессов — митохондриальная дисфункция. В результате митохондриальной дисфункции снижается уровень АТФ в клетке, увеличивается продукция активных форм кислорода и происходит активация механизмов клеточной гибели. Определение 4-гидроксифенилуксусной кислоты, изменение соотношения лактат/пируват в сыворотке крови и эндометрии являются чувствительными метаболитами функционирования митохондрий и отражает структурно-функциональную неполноценность эндометрия и плохой прогноз течения и исхода последующей беременности.