Метаболомика стероидных гормонов по данным газовой хромато-масс-спектрометрии у женщин с различными фенотипами синдрома поликистозных яичников с нормальной массой тела

Введение

До настоящего времени единой классификации гиперандрогении (ГА) нет. Большинство исследователей выделяют две основные формы — опухолевую и неопухолевую, или функциональную, которую в зависимости от генеза нарушений подразделяют на яичниковую, надпочечниковую и смешанную. Кроме того, различают ГА истинную, рецепторную и транспортную [1]. Наиболее частыми причинами ГА являются синдром поликистозных яичников (СПЯ) и неклассическая форма врожденной дисфункции коры надпочечников (НФ ВДКН), большинство случаев которой обусловлено недостаточностью фермента 21-гидроксилазы [2][3]. Клиническая картина СПЯ и НФ ВДКН может быть схожей и требует проведения дифференциальной диагностики [4]. Для выявления источника ГА используют определение различных гормонов, проводят функциональные пробы на стимуляцию и подавление функции яичников и надпочечников. Определение локализации источника ГА представляет значительные трудности, так как спектр синтезируемых гормонов и ключевых ферментных систем синтеза андрогенов в яичниках и надпочечниках сходны [5].

Широкое применение в определении гормонов нашли методы иммунохимического анализа из-за их высокой чувствительности. Однако низкая специфичность этих методов, наличие перекрестных реакций приводят к возрастанию числа ложноположительных результатов и, таким образом, к гипердиагностике [6]. Так, содержание 17-гидроксипрогестерона (17-ОНП) может быть в пределах нормальных значений у женщин с НФ ВДКН [7]. При СПЯ в половине случаев выявляется повышенный уровень 17-ОНП, ау 20–30% пациентов наблюдается увеличение надпочечниковых андрогенов, таких как дегидроэпиандостерон-сульфат (ДЭА-С). У пациенток с клиническими признаками ГА при базальном уровне 17-ОНП в пределах нормальных значений для выявления источника ГА проводится стимулирующий тест с синтетическим аналогом кортикотропина (тетракозактидом), который является «золотым стандартом» для диагностики НФ ВДКН [8][9].В настоящий момент в России отсутствуют зарегистрированные препараты тетракозактида. У некоторых гетерозиготных носителей мутаций в гене 21-гидроксилазы уровни 17-OHП могут быть такими же, как у пациентов с НФ ВДКН.В использовании генетического тестирования главным препятствием является сложность молекулярно-генетического анализа, а также то, что большинство доступных панелей скрининг-тестов исследуют 10–12 наиболее распространённых мутаций и могут не обнаружить все мутации, которые на сегодняшний день известны [10]. Методы хроматографии позволяют получить стероидные профили крови и мочи, являющиеся наиболее ценными диагностическими тестами для заболеваний, связанных с нарушением синтеза и метаболизма стероидных гормонов [11]. По мнению ряда авторов, оценка стероидных гормонов методом тандемной хромато-масс-спектрометрии является надежным методом диагностики НФ ВДКН, позволяющим существенно снизить число ложноположительных результатов [12]. Другие исследователи придают особое значение определению стероидного профиля мочи (СПМ) методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС), дающим возможность идентифицировать большое число андрогенов, глюкокортикоидов, их предшественников и метаболитов [13][14][15]. Имеются единичные исследования по метаболомике стероидов у больных СПЯ с ожирением. Обнаружено повышение экскреции с мочой прегненов, дегидроэпиандростерона и его метаболитов, метаболитов андростендиона, биологически активных 5α- и 5β-тетрагидрометаболитовглюкокортикоидов, снижение активности фермента 11β-гидроксистероиддегидрогеназы (11β-ГСДГ) 1 типа, что приводит к накоплению неактивных глюкокортикоидов [16][17]. Yuying D. и Yifei Z. обследовали женщин с СПЯ с нормальной массой тела, с избыточной массой тела и с ожирением. Сравнительный анализ показал, что женщины с нормальной массой тела имели признаки недостаточности фермента 21-гидроксилазы при отсутствии мутации в гене в отличие от женщин с избыточной массой тела и ожирением, что также подтверждает разные варианты стероидогенеза [18]. В результате влияния избытка андрогенов у женщин могут проявляться различные по степени выраженности клинические проявления, такие как акне, гирсутизм, алопеция. За проявление адрогенной алопеции и акне, как правило, отвечает 5α-редуктаза, которая превращает тестостерон в более активный андроген дигидротестостерон [16]. Существует две изоформы 5α-редуктазы: 5α-редуктаза 1 и 2 (SRD5A1, SRD5A2). 5α-редуктаза 1 экспрессируется в волосистой части головы, в печени, в яичниках, в матке, в почках и головном мозге, 5α-редуктаза-2 экспрессируется в печени и в меньшей степени, в волосистой части головы и коже [19]. При высокой активности фермента 5а-редуктазы I типа у женщин наблюдают выраженные признаки андрогензависимой дермопатии без других проявлений. В настоящее время имеется немало данных об увеличении активности 5α-редуктазы при СПЯ.

Выделяют 4 фенотипа СПЯ (А, В, С и D) [20]. Фенотип А — классическое сочетание трёх диагностических критериев, а именно гиперандрогении (клинической, биохимической или сочетанной), олиго- и/или ановуляции и поликистозных изменений в яичниках (на основании результатов УЗ исследования). Фенотип В представляет собой комбинацию синдрома гиперандрогении и олиго-ановуляции без эхографических признаков поликистоза в яичниках. Фенотип С включает синдром гиперандрогении и поликистозноизмененные яичники по данным ультразвукового исследования при отсутствии олиго/ановуляции (овуляторный СПЯ). Фенотип D представляет собой комбинацию олигоановуляции и поликистоза яичников по данным эхографии без проявлений синдрома гиперандрогении (неандрогенный СПЯ). По данным различных исследований, посвящённых изучению распространенности фенотипов СПЯ у женщин репродуктивного возраста, установлено, что фенотип А встречается у 44–65 % женщин, фенотип В — у 8–33 %, фенотип С — у 3–29 %, а фенотип D — у 23 % [21][22]. Представляется актуальным поиск дополнительных биохимических маркеров дифференциальной диагностики различных фенотипов СПЯ с использованием методов хроматографии.

Материалы и методы

Обследовано 48 женщин с СПЯ в возрасте от 24 до 29 лет (средний возраст 25±0,3лет) с индексом массы тела (ИМТ), находящимся в референтом интервале 18,5–24,9 кг. Группу контроля (ГК) составили 25 здоровых женщин в возрасте 26 (23-30)лет с нормальным ИМТ. Диагноз СПЯ был диагностирован согласно ASRM/ESHRE (2003), International PCOS Network (2018),согласно которым наличие двух из трёх основных критериев определяет наличие определенного вида (фенотипа) СПЯ. Больные СПЯ были разделены на четырегруппы:15 пациентов с клиническими и биохимическими признаками ГА, ановуляцией и признаками поликистозных изменений яичников (ПКЯ), по данным ультразвукового исследования (фенотип А), 11 больных СПЯ без ПКЯ с ановуляцией и ГА (фенотип В), 9 больных СПЯ с овуляцией, ГА, ПКЯ (фенотип С), 13 пациентов с ановуляцией и признаками ПКЯ, но без ГА составили группу с фенотипом D. Методами иммуноанализа определяли уровни лютеинизирующего гормона (ЛГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), свободного тестостерона,17-ОН прогестерона (17-ОНП), дегидроэпиандростерона сульфат (ДЭА-С), Δ-4-андростендиона, глобулина, связывающего половые гормоны (ГСПГ) в сыворотке крови. Исследовали СПМ методом ГХ-МС с оптимизацией регламента пробоподготовки, для которой выбран вариант жидкостной экстракции. Установлены оптимальные количества дериватизирующих агентов (метоксиамина и триметилсилилимидазола), а также подобраны условия хроматографического анализа [17][23][24]. Всего идентифицировано 69 стероидов. СПМ получены на газовом хромато-масс-спектрометре SHIMADZU GCMS-QP2020. Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием программной системы STATISTICA for WINDOWS (версия 10). Основные количественные характеристики больных представлены в виде медианы (Me), 25-го перцентиля и 75-го перцентиля (Q₂₅–Q₇₅). Для сравнения результатов, полученных в исследуемых группах, использовался непараметрический критерий Манна-Уитни. Статистически значимым считался критерий достоверности р<0,05.

Исследование проведено в соответствии с международными стандартами GCP (Good Clinical Practice).

Результаты

Методом иммуноанализа обнаружено снижение уровня ГСПГ и увеличение уровня свободного тестостерона в сыворотке крови у больных СПЯ с фенотипами А, В и D, общим признаком которых была ановуляция. Увеличение уровня ЛГ и соотношения ЛГ/ФСГ более, чем в 2 раза, в сыворотке крови в сравнении с ГК получены только у больных СПЯ с фенотипами А и В (табл. 1). У больных СПЯ с фенотипами А, B, С и D были повышены уровни 17-ОНП и андростендиона в сыворотке крови, а уровень ДЭА-С был увеличен только у больных СПЯ с фенотипом В в сравнении с ГК (табл. 1).

Методом ГХ-МС были получены различные СПМ у больных СПЯ с фенотипами А, В, С и D.

Экскреции с мочой (ЭМ) дегидроэпиандростерона (ДЭА) была увеличена у всех обследованных больных СПЯ в сравнении с ГК (табл. 2). Следует отметить, что ЭМDЭА была выше у больных СПЯ с фенотипом В (р=0,017) и СПЯ с фенотипом С (р=0,028) в сравнении с СПЯ с фенотипом D. ЭМ метаболитов DHEA — андростендиола-17β (dA2-17β), 16α-ОН-DHEA-2 — повышена у больных СПЯ с фенотипами А, В и С. Увеличение ЭМ андростентриола (dA3) выявлено только у больных с фенотипами А и В (табл. 2).

У больных СПЯ с фенотипом А была увеличена ЭМ метаболитов андростендиона — андростерона (An), этиохоланолона (Еt) и11-ОН-An. У пациентов, имеющих фенотип B, была увеличена ЭМ 5α-метаболитовандростендиона An и 11-ОН-An в сравнении с ГК. Увеличение соотношения 11-ОН-An/11-ОН-Et получено у больных СПЯ с фенотипами А, В, С, что является одним из признаков повышения активности фермента 5α-редуктазы (табл. 3).

У больных СПЯ с фенотипами А, В и С получено увеличение ЭМ тетрагидрометаболитовкортикостерона (5β-ТНВ и 5α-ТНВ) и11-дезоксикортизола (ТНS). У больных СПЯ с фенотипами А и В повышена ЭМ 5α-тетрагидрокортизона (5α-ТНЕ) и кортолонов, а у больных СПЯ с фенотипом D — ЭМ только 5α-ТНВ (табл. 2).

Снижение соотношений 5β-THF/5β-THEи (5β-THF+5α-THF+кортолы)/(5β-THE+5α-THE+кортолоны) у больных СПЯ с фенотипом А указывало на уменьшение активности 11β-гидроксистероиддегидрогеназы (11β-ГСДГ) 1 типа, что способствует увеличению ЭМ неактивных глюкокортикоидов (табл. 3). Функциональный гиперкортизолизм за счёт активации гипоталамо-гипофизарной надпочечниковой системы приводит к синтезу надпочечниковых андрогенов, тем самым дополнительно нарушая процесс фолликулогенеза. Кроме того, снижение активности 11β-ГСДГ 1 типа усиливает метаболизм кортизола, что приводит к компенсаторному увеличению секреции АКТГ и стимуляции стероидогенеза надпочечников, что также подтверждает смешанный характер гиперандрогенемии у женщин с СПЯ.

Признаки увеличения активности 5α-редуктазыразличной степени получены у всех обследованных больных СПЯ. Три признака увеличения активности 5α-редуктазы получены у больных СПЯ с фенотипами А и В: повышение соотношений 11-ОН-An/11-ОН-Et, 5α-ТНВ/5β-ТНВ и 5α-THF/5β-THF. Два признака — у больных СПЯ с фенотипом С: увеличение соотношений 11-ОН-An /11-ОН-Et и 5α-THF/5β-THF. Один признак — у больных СПЯ с фенотипом D: повышение ЭМ 5α-ТНВ и соотношения 5α-ТНВ/5β-ТНВ (табл. 3). Клинические признаки андрогенной дермопатии были более выражены у женщин с СПЯ и фенотипами А и В, что выражалось в более выраженном гирсутизме и акне, располагающимся на лице, спине и груди.

Увеличение ЭМ прегнантриола (Р3) и прегнентриола (dP3) были общими признаками нарушений метаболомики прогестагенов у больных СПЯ с фенотипами А, В и С. У больных СПЯ с фенотипом С была дополнительно повышена ЭМ 17-ОН-прегнанолона (17-ОНР), 11-охо-Р3, 6-ОН-прегнанолона (6-ОН-Р), а у больных СПЯ с фенотипами А и В — ЭМ 17-ОНР. У больных СПЯ с фенотипом D была увеличена ЭМ только Р3 в сравнении с ГК (табл. 2). Соотношения (5β-THF+5α-THF+ТНЕ)/Р3 меньше 3,0, (5β-THF+5α-THF+ТНЕ)/17-ОНР — меньше 12 и (5β-THF+5α-THF+ТНЕ)/11-охо-Р3 — меньше 20 в сочетании с увеличением ЭМ Р3, 11-охо-Р3 и 17-ОНР могут указывать на недостаточность 21-гидроксилазы у больных СПЯ с ГА, овуляцией и ПКЯ (фенотип С) (табл. 2).У больных СПЯ с фенотипом С были определены 21-deoxy-THF 108 (75–218)мкг/24 ч и 5-еnе-прегнены: 21-ОН-прегненолон 40 (30-42) мкг/24 ч, 11-ОН-прегнентриол 66 (37–104)мкг/24 ч., не детектируемые у здоровых лиц, что также может указывать на недостаточность фермента 21-гидроксилазы.

Кроме того, выявлено два признака снижения активности 3β-гидроксистероиддегидрогеназы-2 (3β-HSD2) у больных СПЯ с фенотипами А, В и С: уменьшение соотношений (5β-THF+5α-THF+ТНЕ)/DHEA и (5β-THF+5α-THF+ТНЕ)/dP3, что подтверждает смешанный характер ГА у данной группы женщин (табл. 3).

Обсуждение

Гиперандрогения — синдром, обусловленный нарушением секреции и метаболизма андрогенов. Кроме высокой распространённости в популяции, ГА ассоциирована с метаболическими расстройствами, сахарным диабетом 2 типа, сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением репродуктивной функции. Хотя синдром ГА включает в себя заболевания с разной этиологией, но его клинические проявления в большинстве случаев одинаковы: акне, гирсутизм, нарушение менструального цикла, андрогензависимая алопеция. Проблема диагностики и лечения заболеваний, сопровождающихся ГА, в настоящее время является одной из наиболее актуальных в гинекологической эндокринологии [25][26]. СПЯ является самой распространённой причиной синдрома ГА, распространённость которого среди женщин репродуктивного возраста колеблется от 8 до 21% [27]. У больных СПЯ с ГА (с фенотипами А и В) выявлено повышение экскреции с мочой андростерона (5α-метаболита андростендиона), что приводит к увеличению уровня 5α-дигидротестостерона (ДГТ) в крови, который обладает более высокой биологической активностью, чем тестостерон. Уровень ДГТв крови зависит от содержания циркулирующих в крови андрогенов и активности клеточной 5α-редуктазы, отвечает за развитие андрогенной дермопатии. Признаки увеличения активности 5α-редуктазы в различной степени, по данным ГХ-МС, получены при всех фенотипах СПЯ у женщин с нормальным весом: три признака у больных с ГА и ановуляцией (фенотипы А и В), два признака у больных СПЯ с фенотипом С, один признак у женщин с поликистозными яичниками без ГА (фенотип D). Клинические признаки андрогенной дермопатии были более выражены у женщин с СПЯ и фенотипами А и В. По данным ГХ-МС, у больных СПЯ с фенотипами А, В и С получено увеличение экскреции с мочой ДЭА и P3, снижение соотношений суммы тетрагидропроизводных кортизола и кортизона к данным стероидам в сравнении с группой контроля, что является признаками недостаточности 3β-НSD2. Фермент 3β-НSD2 необходим для превращения Δ5-стероидов (прегненолона,17-гидроксипрегненолона и дегидроэпиандростерона) в соответствующие им Δ4-стероиды (прогестерон,17-гидроксипрогестерон и андростендион) [28]. Полученные результаты подтверждают нарушение стероидогенеза как яичникового, так и надпочечникового генеза у данной группы женщин. Чтобы оценить внутриклеточную концентрацию глюкокортикоидов, необходимо определять не только их содержание в плазме, но и активность ферментов, которые участвуют в их метаболизме, например активность 11β-ГСДГ. 11β-ГСДГ 1 типа — это фермент, катализирующий превращение функционально малоактивного кортизона в самый активный глюкокортикоидный гормон кортизол. Признаки недостаточности 11β-ГСДГ 1 типа, по данным ГХ-МС, получены у больных СПЯ с фенотипом А, что совпадает с данными других исследователей, которыми показано наличие снижения активности 11β-ГСДГ 1 типа у женщин с ожирением с классическим фенотипом СПЯ. Фенотип С у больных СПЯ (овуляторный) наименее изучен и сложен в постановке диагноза в отличие от классического фенотипа. В исследовании выявлено повышение экскреции с мочой метаболитов 17-ОН-прогестерона:11-охо-прегнантриола, прегнантриола и 17-гидроксипрегнанолона, снижение соотношений суммы тетрагидропроизводных кортизола и кортизона к данным стероидам. Кроме того, у пациентов с фенотипом С были определены 21-дезокситетрагидрокортизол и неклассические 5-еne-прегнены, что указывает на недостаточность фермента 21-гидроксилазы и требует дальнейшего изучения. Представленные данные указывают на избыточную выработку андрогенов у многих женщин с СПЯ как в яичниках, так и в коре надпочечников. Исследования СПМ методом ГХ-МС позволяют изучить метаболомику стероидных гормонов и определить отличия в их метаболизме при разных фенотипах СПЯ.

Выводы

1. Экскреция с мочой метаболитов андростендиона увеличена у больных синдромом поликистозных яичников с гиперандрогенией и с ановуляцией (с фенотипом А и В), а метаболитов дегидроэпиандростерона — у больных синдромом поликистозных яичников с гиперандрогенией (фенотипы А, В и С).
2. Повышение экскреции с мочой 11-охо-прегнантриола, прегнантриола и 17-гидроксипрегнанолона, снижение соотношений суммы тетрагидропроизводных кортизола и кортизона к данным стероидам, определение 21-дезокситетрагидрокортизола и неклассических 5-еne-прегненову больных синдромом поликистозных яичников с фенотипом С указывают на недостаточность фермента 21-гидроксилазы.
3. Недостаточность 11β-гидроксистероиддегидрогеназы 1 типа выявлена у больных с поликистозными яичниками, гиперандрогенией и ановуляцией (фенотип А), что свидетельствует о наличии функционального гиперкортизолизма в результате избытка биологически низкоактивных глюкокортикоидов.
4. У больных синдромом поликистозных яичников с гиперандрогенией (с фенотипами А, В и С) получено увеличение экскреции с мочой дегидроэпиандростерона и прегнентриола, снижение соотношений суммы тетрагидропроизводных кортизола и кортизона к дегидроэпиандростерону и прегнетриолу в сравнении с группой контроля, что является признаками недостаточности 3β-гидроксистероиддегидрогеназы-2.
5. Признаки увеличения активности 5α-редуктазы по данным газовой хромато-масс-спектрометрии получены при всех фенотипах синдрома поликистозных яичников: три признака у больных с гиперандрогенией и ановуляцией, с поликистозно измененными яичниками и без поликистозных яичников (фенотипы А и В), два признака у больных с фенотипом С, один признак у женщин с поликистозными яичниками без гиперандрогении (фенотип D).