Взаимосвязь уровня поражения генетического аппарата клеток со степенью нарушения репродуктивного здоровья в условиях вредного производства

Введение

На современном состоянии демографической ситуации в России значительно отразилась неблагоприятная социально-экономическая обстановка 90-х гг. В начале 90-х гг. в Российской Федерации отмечали значительное сокращение численности населения из-за отрицательного естественного прироста, что привело к демографическому старению. Оно характеризуется преобладанием людей старших возрастов. Показатель среднего возраста населения в России у мужчин составляет около 33 лет, у женщин — 38 лет, и отмечается его ежегодное повышение. Также данные демографические изменения обусловлены снижением рождаемости среди молодых людей, рожденных в начале 90-х гг. В связи с этим ежегодно уменьшается доля женского населения в возрасте от 18 до 24 лет, что отрицательно сказывается на уровне рождаемости [1]. Обострение демографической проблемы в России обусловлено не только снижением рождаемости, но и ухудшением состояния здоровья населения и ростом смертности.

Репродуктивное здоровье женщин имеет не только медико-социальное, но и общественно-политическое значение, так как от него зависит здоровье будущего поколения. Сохранение репродуктивного здоровья женщин является одним из главных направлений государственной политики. Глава 6 Федерального закона от 21.11.2011 г. № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» рассматривает вопросы сохранения здоровья матери и ребенка, семьи и репродуктивного здоровья. Под репродуктивным здоровьем понимают состояние полного психического, физического и социального благополучия населения.

Состояние репродуктивного здоровья и репродуктивной системы отражается на продолжительности жизни и смертности от различных классов заболеваний. В России осложнения беременности и родов занимают шестое место среди причин смертности населения детородного возраста. От состояния здоровья матери зависит здоровье, качество потомства и перинатальная смертность [2][3].

Осложнения беременности и родов, повышение заболеваемости детей и подростков связано с ухудшением репродуктивного здоровья населения. В последнее время нормальные роды составляют только 25 – 30 %. Внутриутробная гипоксия, врожденные аномалии и синдром задержки роста плода часто встречаются в перинатальной патологии. Примерно 13 – 15 % репродуктивных потерь составляет невынашивание беременности [2][4]. Около пятидесяти детей на каждую тысячу новорожденных рождается с врожденными и наследственными заболеваниями. Перинатальная патология регистрируется у 39 % детей в неонатальном периоде [3][5]. За последнее десятилетие появилась новая большая группа риска по развитию бесплодия у подростков, которые рано начали половую жизнь и употребляют алкоголь, наркотики [6].

Факторы, определяющие состояние репродуктивного здоровья, разделяют на эндогенные и экзогенные. Под эндогенными факторами рассматривают уровень соматического здоровья родителей, репродуктивного здоровья матери и отца, здоровья матери во время беременности, наследственность, инфекции и др. К экзогенным факторам относят условия труда, окружающую среду, социально-экономические показатели жизни, качество медицинского обслуживания и сбалансированность питания.

Воздействию вредных, опасных веществ и неблагоприятных производственных факторов в Российской Федерации подвержены примерно 6 млн человек, из которых больше половины — женщины. Птицеводство — быстро развивающаяся отрасль сельского хозяйства, где большинство работников — женщины. При промышленном производстве птицы женщины сталкиваются со значительным количеством неблагоприятных производственных факторов. К ним относят неудовлетворительный микроклимат: загрязнение воздуха аммиаком, сероводородом, углекислотой, микроорганизмами, органической пылью [7]. Большинство этих факторов обладают мутагенным действием. Несмотря на то, что возникновение нарушений репродуктивного здоровья при влиянии вредных факторов производственной среды доказано экспериментально, пока еще нет научно обоснованной оценки риска этих нарушений.

В последнее время для оценки влияния неблагоприятных факторов окружающей среды, включая действие химических соединений [8], широко используется микроядерный тест [9][10]. Он применяется в клинической практике для выявления и прогнозирования течения многих заболеваний [10][11], а также при экспериментальных исследованиях. Наличие микроядер в клетках может указывать на недостаточную эффективность защитных свойств организма
в ответ на воздействие негативных факторов окружающей среды [12]. Микроядерный тест можно рассматривать как косвенный метод оценки хромосомных повреждений. Он является специфичным и высокоинформативным способом идентификации разрывов хромосом [11][13], а хромосомные аберрации, в свою очередь, имеют положительную корреляцию с рядом гинекологических состояний [14].

Эксфолиативные клетки ротовой полости, являются пограничным эпителием и находятся под непосредственным воздействием вредных факторов производственной среды. Буккальные эпителиоциты обладают чувствительностью к многим экзогенным и эндогенным воздействиям, что приводит к функциональным изменениям, отражающим различные нарушения локального и системного гомеостаза, которые оказывают влияние на жизнеспособность этих клеток и сопровождаются образованием в них микроядер. Наличие микроядер является маркером нестабильности функционирования клеток и указывает на активизацию процессов воспаления и апоптоза [15].

Микроядра являются отдельной частью хроматина вне основного ядра. Протрузии представлены похожей структурой, соединенной с хроматином основного ядра. К ним относятся фрагменты хромосом или отставшие при нарушении веретена деления целые хромосомы, окруженные ядерной оболочкой, соединенной с ядерной оболочкой основного ядра. Увеличение числа встречаемости этих структур в популяциях клеток отражает генотоксическое действие исследуемых факторов (кластогенном и анеугенном) [15].

Цель исследования — определение взаимосвязи уровня поражения генетического аппарата клеток со степенью нарушения репродуктивного здоровья в условиях вредного производства.

Для достижения цели решали следующие задачи:

1) изучить показатели состояния репродуктивного здоровья женщин, находящихся в условиях промышленного экопрессинга;

2) оценить степень мутагенной активности вредных факторов производственной среды птицефабрики с помощью микроядерного теста;

3) определить взаимосвязь уровня поражения генетического аппарата клеток со степенью нарушения репродуктивного здоровья птичниц.

Материалы и методы

Базой исследования явилось ЗАО «Ильичевская племптицефабрика» Ростовской области. В исследовании приняли участие 36 сотрудниц птицефабрики детородного возраста, первая группа — 22 женщины основного производства, контрольная группа — 14 работниц, рабочее место которых не связано с прямым неблагоприятным воздействием факторов производственной среды (административно-управленческий персонал).

Клинико-статистическое исследование включало изучение состояния половой сферы у обследуемых работниц, которое осуществляли в женских консультациях, а также по данным профилактических осмотров с применением
гинекологических исследований. Изучали течение беременности, родов, состояние новорожденных и их развитие в течение первой недели жизни. При осмотре каждая сотрудница заполняла анкету, которая включала данные общего и специального анамнезов (профессиональный маршрут, характер становления менструального цикла, детородная функция, общая и гинекологическая заболеваемость, и др.), заключение гинекологических осмотров и тестов функциональной диагностики. Проводили целенаправленный опрос для выявления данных о бытовых условиях, о семейном и финансовом положениях.

Для определения влияния вредных факторов производственной среды птицефабрики на цитогенетическую стабильность клеток применяли микроядерный тест [9][16]. Для исследования со слизистой оболочки обеих щёк проводили соскоб. Далее использовали осаждение центрифугированием, гипотонизацию и фиксацию эпителиальной суспензии. После нанесения суспензии на сухие охлаждённые стёкла проводили окрашивание флуоресцентным красителем DAPI II (Abbott). Кариологическое исследование проводили с использованием флуоресцентного микроскопа и нефлюоресцирующего иммерсионного масла при увеличении в 1000 раз. На каждом микропрепарате определяли минимум 1000 клеток в монослое. Микроядра определяли как округлые маленькие тела с цельной оболочкой, в одном оптическом поле зрения с ядром. Они одинаковые по цвету и по структуре хроматина с ядром, имеют чётко очерченные границы, но при это полностью отделены от него.

Статистические данные получали при использовании программы Statistica 6,0. Для числовых показателей рассчитывали средние значения и их стандартные ошибки (М ± m). Для оценки межгрупповых различий применяли t-критерий Стьюдента. Достоверными считали данные при вероятности ошибки р < 0,05.

Результаты

При анализе анкетного материала определили, что средний возраст женщин-птичниц I группы соответствовал 35,70 ± 2,03 годам (27 – 45 лет). Средний возраст сотрудниц административного персонала (контрольная группа) составлял 36,07 ± 1,09 лет (31 – 43 лет). На время проведения исследования стаж работы птичниц на птицефабрике составил 12,36 ± 1,36 лет (4 – 22 лет), а женщин, работающих в административном управлении — 11,00 ± 1,17 лет (5 – 20 лет).

Определяя социально-экономический уровень жизни, установили, что среди сотрудниц I группы всего 13,0 % получили высшее образование, в отличие от контрольной группы (71,0 % женщин). Многие обследованные имеют личное жилье с удовлетворительными условиями проживания. Материальный доход в семьях респондентов I группы в 75,0 % случаев соответствует прожиточному минимуму или ниже, тогда как у 78,0 % женщин контрольной группы доход выше.

Несмотря на одинаковый возраст начала менархе (13,05 ± 0,20лет у женщин I группы, 13,07 ± 0,20 лет у женщин контрольной группы), у женщин I группы нарушения менструального цикла регистрировали чаще, чем у женщин контрольной группы. Нормальный менструальный цикл наблюдался только у 22,0 % женщин I группы, в отличие от женщин контрольной группы (52,0 %). В структуре нарушений менструального цикла птичниц (I группа) часто встречались полименорея (63,6 %) и альгодисменорея (59,1 %). Сотрудницы контрольной группы очень часто отмечали олигоменорею (42,9 %) и опсоменорею (35,7 %). Выявили, что длительность стажа работы значительно повышает вероятность нарушения менструальной функции.

Определение особенностей половой жизни показало, что первые половые отношения у многих работниц I группы начались в возрасте 18,91 ± 0,28 лет, в то время как у женщин административного персонала он был более поздним (22,36 ± 0,41 года). При этом количество половых партнёров на момент анкетирования составил от 1 до 3 человек независимо от группы. Жалобы на наличие дискомфорта во время полового акта чаще отмечали женщины контрольной группы (42,8 %). Самым распространенным способом предохранения от беременности у всех опрошенных является использование презервативов (72,7 % — в I группе, 71,4 % — в контрольной группе), реже прерванный половой акт (13,6 % и 14,2 %, соответственно) и гормональная контрацепция (13,7 % и 14,4 %, соответственно).

Анализ акушерского анамнеза показал, что первая беременность у большинства женщин I группы наступила в возрасте 19,68 ± 0,53 лет, а у женщин контрольной группы — в 23,5 ± 0,48 года. На период анкетирования опрошенные I группы отмечали количество беременностей от 3 до 7 (4,14 ± 0,29 беременности), из них среднее число абортов составило 2,23 ± 0,29 (от 2 до 5 абортов). У сотрудниц административного персонала число беременностей варьировало от 2 до 4 (2,21 ± 0,28 беременности), а число абортов — 0,57 ± 0,20 (0 до 2 абортов). Независимо от группы у большинства опрошенных женщин родами закончились две беременности. Самостоятельное родоразрешение отмечали у большинства опрошенных (90,9 % — в I группе,92,8% — в контрольной группе).

При анализе распространённости гинекологической патологии практически у половины женщин отмечали сочетание нескольких заболеваний (57,1 % — у птичниц, 43,0 % — у сотрудниц административного персонала). В структуре гинекологической заболеваемости всех опрошенных первое место занимали воспалительные заболевания (90,9 % — в I группы, 57,1% — в контрольной группе), второе место — заболевания шейки матки (45,4 % и 50,0 % соответственно), третье место — эндометриоз (31,8 % и 35,7 % соответственно), четвёртое место — опухоли яичников (13,6 % и 14,3 % соответственно), пятое место — миома матки (9,1 % 7,1 % соответственно). Большинство опрошенных сотрудниц отмечает, что ухудшение репродуктивного здоровья произошло за время работы на птицефабрике.

В результате исследования буккального эпителия микроядерным тестом у работниц основного производства выявили статистически достоверное увеличение числа клеток с микроядрами в 2,6 раз (р < 0,05), с протрузиями — в 1,8 раз (р < 0,05) при сравнении с результатами женщин административного персонала. У птичниц, на организм которых влияют вредные производственные факторы (I группа), суммарный показатель пролиферации выше в 2,3 раза (р < 0,05). Большинство нарушений ядерного аппарата представлены двуядерными клетками. Они встречались у работниц почти в три раза больше, чем у женщин контрольной группы. Интегральный показатель цитогенетических нарушений женщин I группы также был достоверно выше в 2,0 раза (р < 0,05). Результаты исследования кариологических показателей приведены в таблице.

Таблица / Table

Кариологические показатели буккальных эпителиоцитов у работниц птицефабрики (М ± m)
Cariological indices of buccal epitheliocytes at poultry farm female workers (M ± m)

Примечание: * — значимые отличия от контрольной группы при сравнении данных по критерию Стьюдента (р < 0,05).
Note: * — significant differences from the control group when comparing data by Student’s test (р < 0,05).

Типы некоторых ядерных аномалий буккальных эпителиоцитов, выявленных у сотрудниц птицефабрики, представлены на рисунках 1, 2, 3. 

Рисунок 1. Клетки с микроядрами (окр. DAPI, х1000)
Figure 1. Cells with micronuclei (staining DAPI, х1000)

Рисунок 2. Протрузии (окр. DAPI, х1000)
Figure 2. Protrusions (staining DAPI, х1000)

Рисунок 3. Двухъядерные клетки (окр. DAPI, х1000)
Figure 3. Binucleated cells (staining DAPI, х1000)

Обсуждение

Микроядерный тест является одним из лучших валидированных цитогенетических методов оценки хромосомных повреждений у человека, используемых для оценки повреждений ДНК, вызванных воздействием генотоксических агентов (физических, химических и биологических) и генетической нестабильностью [17]. Микроядерный анализ цитома, применяемый в буккальных эксфолиативных клетках, является наиболее доступным, так как не требует культивирования ex vivo/in vitro [18]. Ряд научных исследований свидетельствует о связи между повышенной частотой встречаемости микроядер и раком полости рта, головы и шеи, а также предраковыми заболеваниями полости рта [19]. Кроме этого установлено, что частота появления микроядер в буккальных клетках может отражать хромосомную нестабильность клеток других органов. Имеется зависимость между количеством микроядер и
риском развития рака и различных возрастных дегенеративных заболеваний. Результаты оценки клеток у женщин с диагнозом рак молочной железы показали, что доля клеток с микроядрами и протрузиями, число многоядерных клеток и клеток с кариорексисом и кариолизизом достоверно увеличены по сравнению с контролем [20]. Установлено, что встречаемость микроядер у здоровых лиц, чьи родственники первой степени родства имели в анамнезе рак, значимо увеличена (p < 0,05), что может быть обусловлено наследственной нестабильностью генома, а не только вредными факторами окружающей среды [21]. Это подтверждается повышенной частотой встречаемости микроядер у пациентов с болезнью Альцгеймера и с синдромом Дауна [19]. Имеются сведения о значимом вкладе химических факторов в формирование микроядер, так исследование буккальных клеток у работников теплиц, подвергшихся воздействию пестицидов, показали, что встречаемость микроядер различных типов была достоверно выше, чем в контрольной группе (p < 0,05) [22]. Как правило, генотоксическое действие оценивается по одному фактору, тогда как в условиях производственной среды на организм человека влияют одновременно несколько вредностей. Примером этому служат профессиональные вредности у птичниц, когда одномоментно организм нагружен вредным действием физических факторов (вредные микроклиматические условия, низкая освещённость, шум, и т.д.), влиянием химических факторов (наличие остаточных количеств пестицидов, агрохимикатов, антибиотиков, гормонов, витаминов и др.), а также воздействием биологических агентов в составе кормовой пыли и пыли от подстилки, содержащей куриный помёт. В исследованиях Leоn-Mejia G. с соавторами [23] показано влияние на кариологические показатели буккального эпителия механиков, подвергшихся хроническому воздействию выхлопных газов дизельных двигателей, содержащих около 200 химических соединений, из которых наиболее токсичны оксиды углерода, азота, углеводороды, в том числе полициклические ароматические углеводороды (бенз(а)пирен и др.). Выявлена достоверная и положительная корреляция между частотой встречаемости микроядер в буккальных клетках и возрастом, стажем, а также вредными привычками (алкоголь табак) и потреблением мяса [23]. Подобный комплексный эффект на формирование микроядер в буккальном эпителии подтверждён и в наших исследованиях, при этом особого внимания заслуживает состояние репродуктивного здоровья. В ряде публикаций отмечается, что повышенная частота появления микроядер на ранних сроках беременности проспективно связана с преэклампсией, ограничением внутриутробного роста и выкидышами [24]. Бесплодные пары демонстрируют более высокую частоту встречаемости микроядер в половых клетках, чем фертильные пары [5].

Заключение

На основании полученных результатов исследования выявлено, что начало половой жизни, частота и характер нарушений менструального цикла, количество родов и абортов, гинекологическая патология значительно различаются в обследуемых группах. Данные показатели зависят от влияния производственных репротоксикантов (прямое или непрямое воздействие), тяжести и напряжённости труда (физический труд или интеллектуальный), а также социально-экономических факторов (низкий уровень дохода и образования). Определено негативное влияние факторов производственной среды на нарушение стабильности клеточного генома. Выявлена прямо пропорциональная зависимость степени нарушения репродуктивного здоровья от уровня поражения генетического аппарата клеток.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Financing. The study did not have sponsorship.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. Authors declares no conflict of interest.