Роль высокоэффективной жидкостной хроматографии в определении функционального состояния надпочечников до и после операции по поводу кортикостеромы

Введение

Всех пациентов после удаления кортикостеромы по поводу синдрома Кушинга (СК) рекомен­дуется вести как больных с острой надпочеч­никовой недостаточностью, так как функция противо­положного надпочечника может быть подавлена [1]. К сожалению, определение уровня кортизола в сыворотке крови и в слюне методом иммуноанализа не всегда до­статочно для диагностики надпочечниковой недостаточ­ности. В настоящее время используют стимуляционный тест с синтетическим аналогом кортикотропина (АКТГ) для оценки дефицита кортизола [2]. В Российской Феде­рации данный препарат не зарегистрирован. В связи с отсутствием высокочувствительных и высокоспецифич­ных методов диагностики надпочечниковой недостаточ­ности представляется актуальным использование хрома­тографических методов.

В 1973 г. W.H. Beierwaltes и соавт. для обозначения ла­бораторно выявляемого гиперкортицизма без клиниче­ских проявлений предложили термин «субклинический синдром Кушинга» [3]. В 2016 г. Европейская ассоциация эндокринологов предложила заменить этот термин на «автономную секрецию кортизола» (АСК) [4]. У паци­ентов с АСК не развивается яркой картины СК, однако исследования показали, что для АСК характерны такие метаболические проявления гиперпродукции глюкокор­тикоидов, как ожирение, нарушение углеводного обмена, артериальная гипертензия, дислипидемия, остеопороз. Механизмы развития субклинической гиперпродукции глюкокортикоидов мало известны, в связи с чем методы консервативного лечения, как альтернативы оперативно­му лечению, не разработаны [5].

Согласно современным международным рекомен­дациям, абсолютными показаниями к проведению хи­рургического лечения АСК являются лучевые признаки злокачественности образования по данным компьютер­ной томографии (КТ) [4]. После оперативного лечения больных с АСК необходимо помнить о возможном раз­витии надпочечниковой недостаточности после хирурги­ческого лечения, в связи с чем рекомендуется проводить послеоперационное лечение глюкокортикоидами. Веро­ятность наличия надпочечниковой недостаточности в послеоперационном периоде у этих больных ниже, чем у больных с СК, поэтому особенно важно уточнение глю­кокортикоидной и минералокортикоидной активности коры надпочечников для решения вопроса о необходи­мости заместительной терапии.

Материалы и методы

Обследовано 93 пациента (19 мужчин и 74 женщи­ны) в возрасте 51,3 ± 10,1 года с объемным образовани­ем надпочечника и 27 здоровых лиц (группа контроля) в возрасте 45,5 ± 5,7 лет. Всем пациентам проводили сбор анамнеза, объективный осмотр, лабораторное и инстру­ментальное обследования. Методами иммунохемилю­минесцентного (ИХЛА) и иммуноферментного анализа (ИФА) определяли уровни АКТГ в плазме крови, альдо- стерона (АЛД), ренина и кортизола в сыворотке крови, метанефрины и норметанефрины в плазме крови и моче, свободный кортизол в слюне (СКС). Проводили подавля­ющие дексаметазоновые тесты (ПДТ) с 1 мг, 2 мг и 8 мг. Методом высокоэффективной жидкостной хроматогра­фии (ВЭЖХ) определяли уровни кортизола (F), кортизона (Е), кортикостерона (В), 11-дезоксикортизола (S), 11-де- зоксикортикостерона (DOC), 11-дегидрокортикостерона (А) и 18-ОН-кортикостерона (18-ОНВ) в сыворотке кро­ви, экскрецию с мочой свободного кортизола (UFF), сво­бодного кортизона (ОТЕ), 18-ОН-кортикостерона (U18- ОНВ) и 6β-гидроксикортизола (U6β-ОНF), рассчитывали соотношения F/E, В/А, UFF/ UFE и U6β-ОНF/ UFF

Согласно клиническим российским (2015 г.) и ев­ропейским рекомендациям (2016 г.), у 20 женщин и 2 мужчин в возрасте 48,1 ± 8,3 лет диагностирован СК, у 31 женщины и 12 мужчин в возрасте 53,7 ± 3,2 лет вы­явлена АСК по данным иммуноанализа. В каждой группе пациентов методом ВЭЖХ дополнительно определялись уровни предшественников и метаболитов кортикостеро­идов в крови и моче и оценивалась активность фермен­тов адреналового стероидогенеза.

Всем больным СК и 20 пациентам с АСК проведена односторонняя адреналэктомия. Показаниями к опера­тивному лечению пациентов с АСК были большой раз­мер образования (43,0 ± 12,9 мм) или наличие признаков возможной злокачественности по данным лучевой диа­гностики (нативная плотность — 25,6 ± 17,3 HU, APW — 55,9 ± 18,9 %).

В первый день после операции всем больным СК и АСК забор крови проводили методом ИХЛА. Всем паци­ентам с СК с 1-го по 3-й дни после операции внутривен­но вводили раствор преднизолона под контролем уровня кортизола в сыворотке крови, определенного методом ИХЛА. На 4-й день после операции пациентов, получаю­щих преднизолон, переводили на таблетированные фор­мы гидрокортизона. Всем прооперированным пациентам с СК и с АСК оценку функционального состояния коры надпочечника на 4-й день после операции (в раннем по­слеоперационном периоде) проводили методами ВЭЖХ и иммуноанализа. По результатам гормонального обсле­дования, проведенного в раннем послеоперационном пе­риоде (РПП), больных, прооперированных по поводу СК, разделили на две подгруппы: первую подгруппу (СК1) составили 17 пациентов с признаками недостаточности глюкокортикоидов (НГ), во вторую подгруппу (СК2) включили 5 больных без признаков НГ, по данным ИХЛА и ВЭЖХ. Средняя суточная доза преднизолона в первый день после операции у пациентов, прооперированных по поводу СК, с признаками НГ в раннем послеоперацион­ном периоде составила 100 ± 36,7 мг/сут, а у пациентов, прооперированных по поводу СК, без признаков НГ в раннем послеоперационном периоде — 75 ± 38,7 мг/сут.

В РПП среди пациентов, прооперированных по пово­ду АСК, только у 5 больных были выявлены признаками НГ в РПП по данным ВЭЖХ. Заместительную гормональ­ную терапию они не получали.

Статистическая обработка и визуализация получен­ных результатов осуществлялись с применением пакета программ для статистического анализа STAПSTIСA for WINDOWS (версия 10) и GraphPadPrism 6. При сравне­нии показателей дооперационного и послеоперацион­ного периодов с показателями группы контроля исполь­зовался непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Для сравнения показателей в динамике применялся тест Вилкоксона. При обработке данных проводился корреля­ционный анализ с использованием коэффициента ранго­вой корреляции Спирмена. Количественные показатели представлены в виде Me (LQ-UQ), где Me — медиана, LQ — нижний квартиль, UQ — верхний квартиль. Кри­терием статистической значимости считали величины р < 0,05. В ДОП для поиска оптимальных пороговых зна­чений прогностических предикторов НГ в РПП исполь­зовали ROC анализ. Исследование проведено в соответ­ствие с международными стандартами GCP.

Результаты

СК был диагностирован у больных с объемным об­разованием коры надпочечника на основании снижения уровня АКТГ (3,5 (3,0 - 7,5) пг/мл; 27,0 (16,0 - 39,0) пг/мл, р<0,0001) в плазме крови, повышения СКС (27,2 (18,6 - 34,9) нмоль/л; 6,6 (4,3 - 9,5) нмоль/л, p<0,0001), уровней кортизола в сыворотке крови в 9 ч., 21 ч. и отсутствия подавления кортизола после ПДТ с 2 мг (548 (450 - 680) нмоль/л; 38,0 (30,0 - 47,0) нмоль/л, p<0,0001) в сравнении с показателями ГК. Уровень кортизола после ПДТ с 8 мг у больных СК не отличался от его фонового уровня и со­ставил 607 (378 - 660) нмоль/л, р=0,51.

АСК диагностирована у больных с объемным образо­ванием коры надпочечника на основании снижения уров­ня АКТГ до 6,4 (4,0 - 9,6) пг/мл, p=0,0002, повышения СКС до 15,9 (13,7 - 28,7) нмоль/л, p<0,0001, увеличения уровня кортизола в 21 ч. и отсутствия подавления кортизола по­сле ПДТ с 2 мг — 153 (109 - 218) нмоль/л, p=0,0007 в сыво­ротке крови в сравнении с показателями ГК.

По данным ВЭЖХ, у больных СК получено повыше­ние уровней F, В, S в сыворотке крови и соотношений F/Е, В/А и UFF/ОТЕ (рис. 1). Полученные результаты указы­вают на повышение глюкокортикоидной функции коры надпочечников и снижение активности 11β - гидрокси- стероиддегидрогеназы 2 типа (11β-ГСДГ 2 типа).

У пациентов с АСК по данным ВЭЖХ получено уве­личение уровня F и соотношения F/E в сыворотке крови (рис. 1). Экскреция с мочой UFF, UFE и U18-OHB была увеличена как у больных СК, так и у пациентов с АСК. Увеличение уровня 18-ОНВ в сыворотке крови у больных СК и его экскреции с мочой у пациентов с СК и с АСК указывают на увеличение минералокортикоидной функ­ции коры надпочечников по данным ВЭЖХ.

В РПП больные, прооперированные по поводу СК, были разделены на две подгруппы в зависимости от уровня кортизола в 9 ч. по данным ИХЛА. Первую под­группу (СК 1) составили 17 пациентов, прооперирован­ных по поводу СК, у которых уровень кортизола в 9 ч. в сыворотке крови был меньше нижних референсных значений ГК (< 70 нмоль/л), во второй группе у 5 боль­ных, прооперированных по поводу СК (СК 2), данный показатель находился в области референсных значений ГК (> 300 нмоль/л). У больных СК 1 получено сниже­ние уровней кортизола в сравнении с показателями ГК, а у пациентов с СК 2 данные показатели не отличались от результатов ГК по данным ИХЛА и ВЭЖХ (рис. 2). В РПП у больных СК 1 были снижены уровни альдостерона и ренина в сравнении с показателями ГК, а у пациентов с СК 2 уровни альдостерона и ренина не отличались от результатов ГК (рис. 3). У больных СК 1 в РПП по дан­ным ВЭЖХ получено снижение уровня В в сравнении с его уровнем в ДОП до 0,4 (0,4-0,5) нг/мл, р=0,018, а у па­циентов с СК2 уровень В не отличался от его уровня в ДОП и составил 0,9 (0,7 - 1,1) нг/мл, р=0,07.

Результаты ВЭЖХ у больных СК 1 и СК 2 в ДОП были сравнены с показателями ГК. Уровень F в сыворотке кро­ви у пациентов с СК 1 (141 (125 - 152) нг/мл; 75,1 (66,3 - 88,9) нг/мл, р<0,0001) и СК 2 (148 (88-179) нг/мл, р=0,01) был увеличен. У больных СК 1 в ДОП были дополнитель­но повышены уровни B, S, 18-OHB и соотношение В/А в сыворотке крови, а также экскреция с мочой U6β-ОНF в сравнении с показателями ГК (рис. 4 А, Б, С). Уровень S (р=0,04) в сыворотке крови был выше у больных СК 1 в сравнении с показателями СК 2 в ДОП. Экскреция с мочой UFF, UFE, U18-OHB, соотношения F/E и UFF/UFE были увеличены у больных СК 1 и СК 2 (рис. 4 Б, С). Та­ким образом, признаки снижения активности 11β-ГСДГ 2 типа получены у пациентов СК 1 и СК 2 (рис. 4 С).

Кроме этого, у пациентов, прооперированных по поводу СК, установлены отрицательные корреля­ционные связи уровня F в сыворотке крови в РПП с уровнем S (R = -0,81) в сыворотке крови и экскреци­ей с мочой Ш8-ОНВ (R= -0,88) в ДОП, а также уровня кортизола, определенного методом ИХЛА, с уровнем В (R= -0,56) и экскрецией с мочой UFE (R= -0,62), U6β-ОНF (R= -0,82) в ДОП. Уровни гормональных показателей в крови и моче в ДОП, по данным ВЭЖХ (В более 3,2 нг/ мл, 18-ОНВ более 3,7 нг/мл, S более 1,3 нг/мл, U18-OHB более 110 мкг/24 ч, 6β-OHF более 300 мкг/24 ч, UFE более 250 мкг/24 ч), с чувствительностью и специфичностью более 80 % предсказывали глюкокортикоидную недоста­точность у больных, прооперированных по поводу СК.

В РПП у больных, прооперированных по поводу АСК, уровни глюкокортикоидных гормонов в сыворотке кро­ви (F, E, B, S, A) не отличались от показателей ГК (p>0,05).

Получено увеличение уровня 18-ОНВ в сыворотке кро­ви и его экскреция с мочой, что указывает на повышение минералокортикоидной функции коры надпочечников (рис. 5).

По данным гистологического исследования, у всех пациентов, прооперированных по поводу АСК, выявлена адренокортикальная аденома. У 5 пациентов, проопе­рированных по поводу АСК со злокачественным потен­циалом 1-3 балла по шкале L.M.Weiss, в РПП, по данным ВЭЖХ, были снижены уровни F, E и S, что свидетельству­ет об уменьшении глюкокортикоидной функции коры надпочечников (рис. 6). В ДОП у данных больных были повышены уровень В (9,9 (8,3 - 19,5) нг/мл; 4,3 (3,9 - 4,6) нг/мл, р=0,03) в сыворотке крови и соотношение B/A (8,5 (4,9 - 9,2); 1,3 (1,0 - 1,5), p=0,02) в сравнении с со­ответствующими показателями ГК и результатами РПП (р=0,02). Уровень В более 8,0 нг/мл в сыворотке крови, по данным ВЭЖХ, в ДОП с чувствительностью 100 % и специфичностью 92,3 % (АиС=0,92) предсказывал разви­тие глюкокортикоидной недостаточности в РПП у боль­ных, прооперированных по поводу АСК.

Обсуждение

Согласно европейским рекомендациям ENSAT, всех пациентов с синдромом Кушинга после удаления опухо­ли надпочечника необходимо вести как больных с острой надпочечниковой недостаточностью, так как функция противоположного надпочечника может быть подавлена [4]. Однако результаты настоящего исследования демон­стрируют отсутствие недостаточности выработки глю­кокортикоидов у ряда пациентов, прооперированных по поводу синдрома Кушинга. В исследовании у 23 % паци­ентов, прооперированных по поводу синдрома Кушинга, не установлены признаки недостаточности глюкокорти­коидов в раннем послеоперационном периоде, то есть не все пациенты, прооперированные по поводу синдрома Кушинга, нуждаются в заместительной гормональной терапии. В дооперационном периоде у пациентов с син­дромом Кушинга без признаков глюкокортикоидной не­достаточности в раннем послеоперационном периоде среднее значение артериального давления было ниже, чем у пациентов с синдромом Кушинга с глюкокорти­коидной недостаточностью. По результатам гистологи­ческого исследования ткани удаленного надпочечника у всех пациентов с синдромом Кушинга была кортикальная аденома (0-2 балла по шкале L.M.Weiss). У пациентов с автономной секрецией кортизола, согласно европейским рекомендациям ENSAT, необходимо помнить о возмож­ном развитии надпочечниковой недостаточности после хирургического лечения, в связи с чем рекомендуется проводить послеоперационное лечение глюкокортикои­дами у всех пациентов с опухолями надпочечников, где имеются доказательства автономной секреции корти­зола, основным признаком которого является уровень кортизола >138 нмоль/л после ночного теста с 1 мг дек- саметазона [4]. Были проанализированы результаты обследования больных, прооперированных по поводу автономной секреции кортизола в раннем послеопераци­онном периоде, и получены признаки надпочечниковой недостаточности (латентное течение) только у 5 паци­ентов. У больных синдромом Кушинга недостаточность глюкокортикоидов была подтверждена данными имму­ноанализа и данными высокоэффективной жидкостной хроматографии, а у пациентов с автономной секреци­ей кортизола — только данными высокоэффективной жидкостной хроматографии. Таким образом, определе­ние глюкокортикоидов и минералокортикоидов мето­дом высокоэффективной жидкостной хроматографии, является актуальным для диагностики латентной над­почечниковой недостаточности. У больных синдромом Кушинга с низким уровнем кортизола в раннем послео­перационном периоде были повышены уровни в крови кортикостерона, 18-ОН-кортикостерона, 11-дезокси- кортизола в дооперационном периоде. Кроме этого, у данных пациентов были выявлены признаки снижения активности 11р-гидроксистероиддегидрогеназы 2-го типа и уменьшение активности фермента CYP3A4, что свидетельствует о нарушении инактивации кортизола в крови и моче. Увеличение данных предшественников глюкокортикоидов и минералокортикоидов можно ис­пользовать в качестве прогностических маркеров над­почечниковой недостаточности в раннем послеопера­ционном периоде у больных с синдромом Кушинга. У 5 пациентов с автономной секрецией кортизола с недо­статочностью глюкокортикоидов в раннем послеопера­ционном периоде прогностическим маркером оказался высокий уровень кортикостерона в дооперационном периоде.

Выводы

1. В дооперационном периоде у пациентов с синдро­мом Кушинга и с автономной секрецией кортизола с признаками недостаточности глюкокортикоидов в раннем послеоперационном периоде были по­вышены уровень кортикостерона и соотношение кортикостерона к 11-дегидрокортикостерону, у пациентов с синдромом Кушинга дополнительно были увеличены уровни 18-ОН-кортикостерона, 11-дезоксикортизола в сыворотке крови и экскре­ция с мочой 6β-гидроксикортизола в отличие от пациентов с синдромом Кушинга и с автономной секрецией кортизола без признаков недостаточно­сти глюкокортикоидов в раннем послеоперацион­ном периоде.
2. По данным высокоэффективной жидкостной хро­матографии выявлены пороговые значения уров­ней кортикостерона (3,2 нг/мл), 11-дезоксикорти- зола (1,3 нг/мл), 18-ОН-кортикостерона (3,7 нг/мл) в сыворотке крови и экскреции с мочой свободного кортизона (250 мкг/24 ч), 18-ОН-кортикостерона (110 мкг/24 ч) и 6β-гидроксикортизола (300 мкг/24 ч) у больных синдромом Кушинга, при превыше­нии которых в дооперационном периоде имеется риск развития недостаточности коры надпочеч­ников в раннем послеоперационном периоде, что подтверждается наличием отрицательной корре­ляции с уровнем кортизола после операции.
3. Для пациентов с автономной секрецией кортизола и злокачественным потенциалом 1-3 балла по шка­ле L.M. Weissуровень кортикостерона в сыворотке крови больше 8,0 нг/мл в дооперационном периоде с чувствительностью 92 % и специфичностью 100 % указывает на возможность развития недостаточ­ности коры надпочечников в раннем послеопера­ционном периоде.

Финансирование. Исследование не имело спонсор­ской поддержки.
Finansing. The study did not have sponsorship.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. Authors declares no conflict of interest.