Рак пищевода входит в десятку мировых лиде­ров среди злокачественных новообразований с наихудшим прогнозом, занимая восьмое место как наиболее распространённая форма рака во всем мире (примерно 456 тыс. новых случаев в 2012 г. — 3,2% от общего числа) и шестое место как наиболее частая при­чина смерти от рака (около 400 тыс. смертей — 4,9%от общего числа), по данным Globoscan 2012 (IARC) [1]. В России же в структуре заболеваемости среди всех злока­чественных новообразований рак пищевода находится на 14-м месте, а смертности — на 7-м. Пятилетняя вы­живаемость при раке пищевода составляет около 10%, причем зависимости от гистологического типа опухоли и степени опухолевой дифференцировки пока не выявлено [2]. В литературе есть единичные данные о зависимости выживаемости пациентов от степени морфологической дифференцировки опухоли, что нашло отражение в про­гнозе отдаленных результатов между аденокарциномой и плоскоклеточным раком при I и II стадиях заболева­ния. Так, если при аденокарциноме прогноз оказался достоверно лучше при G1 и G2 (высоко- и умеренно­дифференцированные опухоли), по сравнению с G3 (низкодифференцированные), то при плоскоклеточном раке значимые различия отмечены при G1 как против G2, так и против G3. Кроме того, для плоскоклеточного рака пи­щевода T2-3N0M0 показаны различия при локализации опухоли в верхне-среднегрудном и нижнегрудном отде­лах пищевода [3]. На сегодняшний день применяется раз­личный спектр маркеров для иммуногистохимического анализа опухолей и их метастазов: рецепторы, молекулы клеточной адгезии, белки регуляторы клеточного цикла и апоптоза. Однако их прогностическое значение при раке пищевода (РП) остается дискуссионной областью. Прогностическое значение аберрантной экспрессии р53, обнаруживаемое иммуногистохимически, при РП оста­ется неясным. В ряде работ [4] показано, что белок p53 может быть обнаружен иммуногистохимически в 52-67% плоскоклеточных карцином пищевода, однако его гипе­рэкспрессия не оказывает влияния на прогноз заболева­ния. Напротив, в исследованиях Madani K. [5] и Wang L. [6], показано, что ИГХ- обнаружение повышенной экс­прессии p53 является предиктором низкой 5 летней вы­живаемости, более развитых стадий TNM, метастазов в лимфатические узлы у пациентов с РП и, соответственно, может быть полезным биомаркером неблагоприятного прогноза заболевания. То есть вопрос о прогностической ценности р53 остается актуальным и в настоящее время.

В исследовании Wei W. [7] показано, что в тканях карциномы пищевода уровень экспрессии p53 положи­тельно коррелировал с белком bcl-2. Это позволяет пред­положить, что изменения экспрессии bcl-2 могут кор­релировать с прогрессированием опухоли при РП, что подчеркивает их важность в качестве прогностических маркеров. Важнейшей характеристикой опухоли являет­ся ее пролиферативная активность (ПА), современным методом определения которой служит оценка индекса ki- 67-положительных клеток. Антиген ki-67, выявляемый в ИГХ-исследовании соответствующими моноклональ­ными антителами, представляет собой короткоживущий протеин, который разрушается в течение 1,5-2 часов. Поэтому антитела к ki-67 выявляют только делящиеся клетки, так как ki-67 не успевает накапливаться и не оста­ется в покоящихся клетках [8]. Таким образом, именно данные маркеры позволяют детально охарактеризовать биологическое поведение опухоли, связанное с активно­стью процессов пролиферации и апоптоза. Но некоторые аспекты их прогностического значения при РП требуют уточнения и, следовательно, дополнительных исследова­ний.

Цель исследования — изучить экспрессию молекуляр­но-биологических маркеров р53, bcl-2 и ki-67 иммуногистохимическим методом при раке пищевода в зависимо­сти от стадий заболевания и степени дифференцировки, а также оценить их использования для прогнозирования течения злокачественного процесса.

В группу исследования вошли 30 пациентов ретро­спективной группы с II-III стадией заболевания, кото­рые получили хирургическое лечение по поводу рака пищевода в Ростовском научно-исследовательском он­кологическом институте в период с 2009 по 2016 гг. По показаниям была выполнена операция в следующем объ­еме: субтотальная резекция пищевода, проксимальная резекция желудка с одномоментной внутриплевральной пластикой пищевода желудочным стеблем. Всем боль­ным стандартно выполняли двухзональную лимфодиссекцию. Специальной (системной и локальной) противо­опухолевой терапии не проводилось. Возраст больных варьировался от 33 до 76 лет, медиана возраста составила 57,8 года. Соотношение мужчин к женщинам было 2,8 к 1, что в процентном соотношении составляло 73,9% муж­чин и 26,1% женщин.

Иммуногистохимическое исследование было про­ведено на срезах парафиновых блоков, предназначен­ных для стандартного морфологического исследования, с помощью моноклональных антител к p53 (клон DO-7, DAKO, концентрация 1:100), bcl-2 (клон Sp 66, DAKO, концентрация 1:100), ki-67 (клон H3060, Spring Biosience, концентрация 1:200), E-кадгерину (клон EP700Y, Thermo scientific, концентрация 1:100). Депарафинизацию и деги­дратацию парафиновых срезов выполняли по стандарт­ной методике. “Демаскировку” антигенов проводили в PT-LinkThermo, согласно протоколу. Окрашивали в ав­томатическом режиме с применением иммуностейнера Thermo Scientific 480. Визуализация иммуногистохимической реакции выполнялась с использованием системы детекции Reveal Polyvalent HRP-DAB DetectionSystem, докрашивали срезы гематоксилином Майера. Оценку результатов иммуногистохимической реакции проводи­ли с применением светового микроскопа «Micros Austria MC300» (Австрия) под увеличением х10, х40. Опухоль считали положительной по р53, если было окрашено более 25% ядер опухолевых клеток и положительной по bcl-2 при наличии цитоплазматического окрашивания более 25% опухолевых клеток. Для оценки пролифера­тивной активности (ПА) подсчитывали количество ki- 67-положительных клеток, приходящихся на 200-300 опухолевых клеток. Индекс ki-67 определяли по формуле: ПА= число ki-67 положительных клеток х 100/общее ко­личество клеток. Маркеры пролиферативной активности расценивали на основе наиболее часто употребляюще­гося способа оценки пролиферативной активности: 0%- 20% — низкая пролиферативная активность, 21%-50% — умеренная пролиферативная активность, 51%-100% — высокая пролиферативная активность.

Полученные данные обрабатывали методом стати­стической обработки на персональном компьютере с ис­пользованием электронных таблиц Excel 2013 и пакета прикладных программ Statistica 8.0 [9]. Различия между группами оценивались с помощь t-критерия Стьюдента.

В ходе исследования была определена частота экс­прессии p53 и bcl-2 в зависимости от стадии (табл. 1). В ядрах опухолевых клеток РП II стадии экспрессия р53 была отмечена в 100% (n=15), разброс количества окра­шенных клеток при этом находился в пределах от 5% до 80% клеток, и в 66,7% (10 из 15) достиг точки разделения «cut-off» в 25% ядер опухолевых клеток. В группе боль­ных РП III стадии накопление р53 в ядрах клеток встре­чалось также в 100% случаев (n=15), разброс клеток по экспрессии данного маркера находился в пределах от 10% до 80% ядер опухолевых клеток, и в 73,3% случаев (11 из 15) превысил значения «cut-off».

Накопление bcl-2 было обнаружено в цитоплазме опухолевых клеток РП II стадии в 86,7% (13 из 15) слу­чаев (табл.1). Несколько реже — в 66,7% (10 из 15) случа­ев — отмечена положительная реакция окрашивания к антителам bcl-2 цитоплазмы опухолевых клеток при РП III стадии. При этом в каждом из исследованных случа­ев отмечалось положительное окрашивание антителами к bcl-2 инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, что яв­лялось для нас внутренним положительным контролем.

Средние значения экспрессии исследованных мар­керов в зависимости от стадии заболевания отражены в табл. 2. Из представленных в ней данных видно, что среднее содержание p53+ клеток в опухолях пищевода III стадии в 1,4 раза превосходит аналогичный показатель в опухолях II стадии (различия статистически достоверны, p<0,05).

Количество bcl-2+ клеток при II стадии колебалось от 5 до 70%, в среднем составляя 51,1±7,8%, тогда как при III стадии — от 5 до 65% со средними значениями 33,7±4,9%. Таким образом, прослеживалась тенденция к повышению процента bcl-2+ клеток в опухоли при II ста­дии. Кроме того, были выявлены и некоторые различия в интенсивности окрашивания цитоплазмы опухолевых клеток в зависимости от стадии заболевания. Так, при опухолях пищевода II стадии цитоплазма клеток, как правило, имела яркую (в 46,7% случаев) или среднюю (в 53,3% случаев) интенсивность окрашивания и характери­зовалась диффузным накоплением bcl-2. При опухолях III стадии отмечен диффузный характер окрашивания преимущественно средней интенсивности (в 80% случа­ев), а яркое окрашивание цитоплазмы наблюдалось в 20% случаев.

Доля пролиферирующих ki-67 положительных клеток в опухолях II стадии находилась в пределах от 10% до 70% клеток, при III стадии от 10% до 80%. Средние значения экспрессии ki-67 в опухолях III стадии превышали соот­ветствующий показатель опухолей II стадии в 1,7 раза (р<0,05) (табл.2).

Проведенное иммуногистохимическое исследование пролиферативной активности (ПА) опухолей пищевода в зависимости от стадии заболевания выявило преобла­дание опухолей с низкой и умеренной ПА при II стадии, тогда как при III стадии преобладали опухоли с высокой ПА. Соотношение доли опухолей с низкой ПА к доле опу­холей с высокой ПА при II стадии составило 9, а при III стадии — 1,2.

Итак, по мере нарастания распространенности РП отмечается повышение частоты встречаемости и уровня экспрессии р53+ и маркера пролиферации ki-67, а также пролиферативной активности опухолевых клеток. При этом в опухолях II стадии отмечена тенденция к более ча­стой и интенсивной экспрессии bcl-2, чем при III стадии.

Также был проведен сравнительный анализ частоты экспрессии p53, bcl-2 в зависимости от степени дифференцировки опухоли (табл. 3).

При оценке пролиферативного потенциала опухолей пищевода II и III стадии заболевания выявлено наличие среди каждой из них опухолей с низкой, умеренной и вы­сокой пролиферативной активностью. Полученные ре­зультаты представлены на рис. 1.

Как видно из приведенных в табл. 3 данных, было выявлено возрастание доли р53+ случаев с увеличением степени злокачественности. Так, при G1 и G2 доля p53+ опухолей составила 66,7% (2 из 3) и 63,2% (7 из 12) соот­ветственно, тогда как при G3 доля таких опухолей в 1,3 и 1,4 раза превосходила показатель G1 и G2 опухолей. Максимальное количество bcl-2+ опухолей было выявле­но при G2, а именно в 84,2% случаев (16 из 19) в 1,3 раза ниже была их частота при G1 и G3- степени дифференцировки (в 66,7% и 62,5% случаев соответственно).

Результаты же количественной оценки экспрессии исследованных маркеров в зависимости от степени дифференцировки опухоли представлены в табл. 4. Анализ полученных данных позволил выявить, что среднее со­держание p53+ клеток в опухолях пищевода G3 степени дифференцировки в 2 и 1,4 раза превосходило анало­гичный показатель опухолей G1 и G2 (в обоих случаях различия статистически достоверны, p<0,05). При этом достоверной разницы средних значений экспрессии p53 между G1 и G2 опухолями выявлено не было, хотя этот показатель при G2 опухолях в 1,4 раза был выше в срав­нении с G1 опухолями. Разброс количества p53 позитив­ных клеток при G1 находился в пределах от 5% до 70%, при G2 от 20% до 70%, и при G3 — от 55% до 85%.

Минимальное среднее значение экспрессии bcl-2 было выявлено при низкодифференцированных опухо­лях (табл.4). Данные показатели были в 1,7 раза ниже со­ответствующих показателей Gl и G2 опухолей (p<0,05), между которыми различий не обнаружено. Разброс ко­личества bcl-2+ клеток опухоли при Gl степени дифференцировки был от 5 до 70%, при G2 — от 10 до 70%, при G3 — от 5 до 55%. Были также выявлены некоторые различия интенсивности окрашивания цитоплазмы опу­холевых клеток в при разной степени дифференцировки опухоли. Так, в опухолях пищевода Gl и G2 степени дифференцировки окрашивание цитоплазмы клеток харак­теризовалось яркой и средней интенсивностью (в 66,7% и 84,2% случаев соответственно), тогда как опухоли G3 характеризовались средней интенсивностью окрашива­ния в 100% исследованных случаев.

Из данных табл. 4 также видно, что доля пролифе­рирующих ki-67+ клеток в опухолях GI степени дифференцировки находилась в пределах от 10% до 50% клеток, тогда как при G2 и G3 от 10% до 80%. Средние значения экспрессии ki-67 в опухолях низкой степени дифференцировки в 1,4 раза превышали значения в опухолях G2 (p<0,05); при этом статистически достоверных различий экспрессии ki-67 между опухолями G1 и G2 выявлено не было.

При оценке пролиферативной активности опухолей пищевода в зависимости от степени дифференцировки выявлены некоторые различия (рис. 2). Так, превалиру­ющими среди G1 опухолей были те, у которых ПА соот­ветствовала низким значениям, опухолей с высокой ПА среди G1 нами выявлено не было. Напротив, опухоли G2 в большинстве случаев характеризовались низкой ПА, тогда как доля опухолей с умеренной и высокой ПА при G2 была равной. Половина опухолей G3 имела высокую ПА. Соотношение доли опухолей с низкой ПА к доле опу­холей с высокой ПА при G2 степени дифференцировки составило 4,3, при G3 - 0,25.

Проведенное иммуногистохимическое исследование выявило различия в частоте встречаемости и экспрес­сии молекулярно-биологических маркеров (p53, bcl-2 и ki-67), контролирующих апоптоз и пролиферацию в за­висимости от стадии заболевания и степени дифференцировки опухоли.

По мере нарастания распространенности рака пище­вода отмечалось повышение частоты встречаемости и уровня экспрессии р53+ и маркера пролиферации ki-67, а также пролиферативной активности опухолевых клеток. При этом в опухолях II стадии была отмечена тенден­ция к более частой и интенсивной экспрессии bcl-2, чем при III стадии. Уменьшение степени дифференцировки РП характеризовалось повышением как доли опухолей, экспрессирующих р53 и ki-67, так и уровня экспрессии данных маркеров опухолевыми клетками. При этом экс­прессия bcl-2 имела противоположную направленность.

В результате ИГХ исследования были выявлены раз­личия в частоте встречаемости и экспрессии молекуляр­но-биологических маркеров, контролирующих апоптоз и пролиферацию в зависимости от традиционных клини­ко-морфологических параметров опухоли (стадии и сте­пени дифференцировки).

Выявленные различия экспрессии p53, bcl-2 и ki-67 в ткани плоскоклеточного рака пищевода могут быть ис­пользованы для прогнозирования течения злокачествен­ного процесса.