член-корр. РАН, д.м.н., профессор, генеральный директор
к.б.н., с.н.с. лаборатории молекулярной онкологии,SPIN-код: 8382-4460, AuthorID: 794680, Scopus Author ID: 55328886800
аспирант
доктор медицинских наук, профессор, главный врач
д.б.н., профессор, заместитель генерального директора по науке
к.б.н., руководитель лаборатории молекулярной онкологии
Objective: lymph node metastases occur in 90% of cases in patients with gastric adenocarcinoma, and survival is less than 15% in the late stages of disease. Therefore, the purpose of the study was to screening markers for predicting the likelihood of metastases developing in gastric adenocarcinoma. Materials and methods: for the study 47 patients with diagnosis of gastric adenocarcinoma were used (with the localized tumor form T3-4N0M0 (n = 18) and the locally distributed form T3-4N1-3M0 (n = 29)). The copy number variation of 16 genes (APC, AURKA, CCND1, C-MYC, GKN1, HER2, IRX1, MDM2, MET, NFKB, OCT1, P53, PIK3CA, POU5F1B, S6K2 and HV2) was determined by RT-PCR. Immunohistochemical studies were performed on sections of paraffin blocks using monoclonal antibodies to p53, Bcl-2, Ki-67 and Her2. Results: the loss of duplicity of HV2 locus was most frequent CNV in samples of stomach adenocarcinoma, but CNV significant change in the T3-4N0M0 group relative to T3-4N1-3M0 was not detected. A significant increase of CNV in the T3-4N1-3M0 group relative to T3-4N0M0 was found in 2 of 16 loci - NFKB and HER2 in 1.75 and 1.90 times (p<0.0005), respectively. Th e value of p53 expression in the tumor cells nuclei in the group without metastases was lower by 52% compared to the expression in the metastatic group (p<0.05). Low proliferative activity prevailed in the group without metastases in contrast to the group with metastases, in which Her2 overexpression was also observed in 43% of cases in contrast to 20% of cases in the group without metastases. Conclusions: it was showed that the relative copies number of NFKB1 and HER2 in combination with the immunohistochemical parameters of Ki67 and HER2 in gastric tumors can be a prognostic marker of metastasis, and algorithm for predicting metastases development in gastric adenocarcinoma is formed on basis of this.
Во всем мире ежегодно диагностируется более 900 тыс. случаев рака желудка, что ставит данное заболевание на пятое место по распространенности среди всех онкологических заболеваний. Рак желудка является третьей ведущей причиной смерти от злокачественных новообразований в мире после рака легкого и рака печени. По данным за 2015 год, ежегодно от данного заболевания умирает более 800 тыс. человек [
Аденокарцинома желудка составляет 95% от общего числа злокачественных новообразований данного органа [
Изменение копийности генов (Copy Number Variation или CNV) является одним из основных механизмов контроля раковой клеткой ключевых для выживания и малигнизации сигнальных путей. Копийность генов - вид генетического полиморфизма, возникающий в результате несбалансированных хромосомных перестроек, таких как делеции и дупликации. Результатом вариации может явиться снижение или повышение числа копий определенного гена, и, следовательно, пониженная или повышенная экспрессия продукта гена - белка или не кодирующей РНК. CNV представляют собой критические генетические события, которые способствуют развитию и прогрессированию злокачественных новообразований у человека [
CNV являются следующим уровнем в понимании молекулярного контекста развития опухолевого процесса, включая метастазирование [
Не менее надежным маркером в прогнозировании развития метастазов является оценка показателей экспрессии белков. Так, при изучении аденокарциномы пищевода отмечается неблагоприятный прогностический эффект при избыточной экспрессии белка HER2 [
Область исследования экспрессии HER2 в последнее время значительно расширилась, охватив такие нозологии как рак молочной железы и рак желудка. Чувствительность и специфичность для диагностики аденокарциномы пищевода составляют 88 и 100% соответственно при одновременном гистохимическом определении HER2, c-myc, и анеуплоидии [
Особое значение в прогнозировании поведения опухоли придают ее пролиферативной активности. Наиболее распространенным маркером пролиферации является регуляторный белок Ki 67. Несмотря на общее использование Ki 67 для индексации клеточной пролиферации, его прогностическая значимость при плоскоклеточном раке пищевода остается неубедительной. В трех исследованиях, включавших в общей сложности 192 пациента, наблюдался незначительный прогностический эффект этого маркера [
Ki 67 является надежным индикатором пролиферации практически во всех опухолевых образованиях человека. Антиген Ki 67, выявляемый соответствующими моноклональными антителами, представляет собой короткоживущий протеин, он разрушается в течение 1,5-2 часов. Поэтому, антитела к Ki 67 выявляют только делящиеся клетки, так как Ki-67 не успевает накапливаться и не остается в покоящихся клетках [
Транскрипционный фактор NFΚB (ядерный фактор «каппа-би») контролирует экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла. Нарушение регуляции NFKB вызывает воспаление, аутоиммунные заболевания, а также развитие рака. Так как одним из важных свойств NFKB является его способность защищать клетку от апоптоза, гены его субъединиц относят к протоонкогенам. В норме активность сигнального пути NFKB в клетке находится под строгим контролем, однако мутации различных генов могут стать причиной его конститутивной активации. Это имеет место при лимфомах разного происхождения, множественной миеломе и раке [
Значительный объем материала представлен в литературе [
Целью исследования — формирование панели маркеров для прогнозирования вероятности развития метастазов в лимфоузлы у пациентов с диагнозом аденокарцинома желудка на основании комплексного использования показателей относительной копийности генов и иммуногистохимической экспрессии белков, выбранных в процессе анализа баз данных и литературных источников.
Клиническим материалом для исследования послужили ткани (опухолевые и условно здоровые) 47 пациентов Юга России с гистологически подтвержденным диагнозом аденокарцинома G2-G3. Медиана возраста пациентов составила 67 лет (от 36 до 83 лет). По клинической классификации заболевания были сформированы две группы пациентов: с локализованной формой опухоли T3-4N0M0 (n=18) и местнораспространенной формой рака желудка T3-4N1-3M0 (n=29) (табл. 1).
Таблица/Table 1.
Клинико-морфологическая характеристика пациентов
Clinical and morphological characteristics of patients
ХарактеристикаCharacteristic | ПеременныеVariables | Количество (%)Quantity (%) |
---|---|---|
Клиническая классификация | T3-4N0M0 | 18 (38%) |
Clinical classification | T3-4N1-3M0 | 29 (62%) |
Стадия дифференцировки опухоли (G)The stage of tumor differentiation (G) | 2 | 24 (51%) |
2-3 | 12 (26%) | |
3 | 11 (24%) | |
ПолGender | Женщины | 14 (30%) |
women | ||
Мужчиныmen | 33 (70%) | |
Возраст, лет | <60 | 11 (23%) |
Age, years | >60 | 36 (77%) |
Геномную ДНК экстрагировали из свежезамороженных операционных биоптатов тканей желудка с использованием лизирующего SDS-содержащего буфера в присутствии протеиназы-К и последующей фенол-хлороформной экстракцией [
Принцип метода RT-qPCR заключается в одновременной амплификации гена-мишени и референсного гена в опытной и контрольной пробах. Вывод об изменении копийности гена делали на основании анализа соотношения сигналов, продуцируемых ампликонами изучаемой и референсной последовательностей, относительная величина определяется методом ΔΔCt [
Количественная RT-PCR амплификация проводилась с использованием термоциклера CFX96 (Bio-Rad, USA) в соответствии с инструкциями производителя по следующей программе: 95 °C 3 мин., и 40 циклов при 95 °C 10 сек, 58 °C 30 секунд (чтение оптического сигнала красителя FAM для красителя SYBR-Green) и 72 °C 15 секунд. Первичные данные RT-qPCR получали с использованием программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager (ver. 3.1). Генетический локус B2M использовали в качестве референсного для нормализации полученных показателей количественной RT-qPCR.
Относительную копийность (rC) вычисляли по формуле: rC= rCопухоль/ rCнорма =2-ΔCt (опухоль)/ 2-ΔCt (норма), где ΔCt=Ct(исследуемого гена) – Ct(B2M)).
Параллельно проводят иммуногистохимическое исследование на срезах парафиновых блоков, предназначенных для стандартного морфологического исследования, с помощью моноклональных антител к p53, Bcl-2, Ki-67 и c-erbB2 (Her2neu).
Депарафинизацию и дегидратацию парафиновых срезов выполняли по стандартной методике. «Демаскировку» антигенов проводили в PT-Link Thermo. Согласно протоколу, вначале срезы подвергались предварительному нагреву до 650С, далее происходило восстановление антигена в течение 20 минут при температуре 970С и охлаждение до 650С. После этого стекла промывали в течение 1-3 минут TBS-буфером (Dako) и помещали в автостейнер Thermo Scientific для окрашивания в автоматическом режиме. Визуализация иммуногистохимической реакции выполнялась с использованием системы детекции Reveal Polyvalent HRP-DAB Detection System. Перед заключением покровных стекол под бальзам Bio-Mount, срезы докрашивали гематоксилином Майера. Оценку результатов иммуногистохимической реакции проводили с применением светового микроскопа «Leica» (Германия) под увеличением х10, х20, х40.
В исследовании применяли следующие критерии оценки маркеров:
ПА (%)= число ki-67 положительных клеток х 100/ общее количество клеток
Маркеры пролиферативной активности расценивали на основе наиболее часто употребляющегося способа оценки пролиферативной активности: 0%-20% — низкая пролиферативная активность, 21%-50% — умеренная пролиферативная активность, 51%-100% — высокая пролиферативная активность.
Полученные данные обрабатывали с использованием электронных таблиц Excel 2010 и пакета прикладных программ Statistica 8.0. Для оценки полученных результатов использовали непараметрические критерии (медиана, персентили 0,25 и 0,75, критерий Манна-Уитни, коэффициент корреляции Спирмена). Для сравнения частот встречаемости событий использовали критерий χ2 с оценкой правдоподобия точным критерием Фишера.
Для построения «Heatmap» и расчёта корреляционных связей между показателями относительной копийности 16-ти генетических локусов в группах T3-4N0M0 и T3- 4N1-3M0 использовали среду программирования R.
Изменение относительной копийности генетических локусов у больных с аденокарциномой желудка
В ходе исследования получены данные об относительной копийности (rC) 15-тиядерных генов-участников ключевых сигнальных путей, регулирующих рост клетки, выживание, метастазирование и устойчивость к химиотерапии (APC, AURKA, CCND1, C-MYC, GKN1, HER2, IRXl, MDM2, MET, NFKB, OCT1, P53, PIK3CA, POU5F1B и S6K2) и некодирующего локуса HV2 мтДНК, у пациентов с локализованной формой опухоли T3-4N0M0 и местнораспространенной формой рака желудка T3-4N1-3M0 (рис. 1).
Рисунок 1. Относительная копийность 16-ти генетических локусов в группах T3-4N0M0 и T3-4N1-3M0.
Figure 1. Relative copy number of 16 genetic loci in groups T3-4N0M0 and T3-4N1-3M0.
В целом, 70% образцов опухолей желудка продемонстрировали амплификацию и/или потерю хотя бы по одному локусу. Наиболее частыми CNV-изменениями в образцах аденокарциномы желудка стала потеря копийности локуса мтДНК HV2 в 15-ти случаях (32%), кроме этого в трёх случаях HV2 был амплифицирован, по сравнению с неопухолевой тканью желудка. Тем не менее, достоверного изменения копийности в группе T3-4N0M0 относительно T3-4N1-3M0 не обнаружено.
Статистический анализ (критерий Манна-Уитни) выявил достоверное изменение копийности в группе T3- 4N0M0 относительно T3-4N1-3M0 только 2 из 16 локусов NFKB и HER2. У пациентов с местнораспространенной формой рака желудка наблюдалось увеличение копийности генов NFKB и HER2 в 1,75 и 1,9 раза (p<0,0005), по сравнению с копийностью этих генов у пациентов с локализованной формой опухоли.
Согласно корреляционному анализу полученных данных, выявлены прямые статистически достоверные ассоциации между амплификацией онкогенов NFKB и POU5F1B и метастазирование в региональные лимфоузлы (р<0,005). Также построение тепловых карт на основе коэффициента корреляции Спирмена, показывает значительные отличия в межгенной корреляции показателей копийности в группе пациентов с метастазами от группы пациентов без метастазов (рисунок 2). Как видно из представленных данных в опухолевой ткани желудка пациентов без метастазов преобладает отрицательная корреляции (при этом медиана (r)=-0,02), в противоположность группе пациентов с метастазами (при этом медиана (r)=0,10).
Рисунок 2. «Heatmap» корреляционных связей между показателями относительной копийности 16-ти генетических локусов в группах T3-4N0M0(слева) и T3-4N1-3M0(справа) (анализ выполнен в среде R).
Figure 2. «Heatmap» correlations between parameters relative copy number of 16 genetic loci in groups T3-4N0M0 (left) and T3-4N1-3M0 (right) (analysis is performed in R).
Условно генетические локусы, вошедшие в настоящую работу, можно разделить на группы — группу ллкусов, редко изменяющих свою копийность в выборке (менее 10%), таких как P53, MDM2, AURKA, IRX1, MET, PIK3CA, S6K2, и на группу «мажорных» маркеров, таких как C-MYC, NFKB, CCND1, HER2, HV2, POU5F1B, OCT1.
В табл. 2 представлена оценка эффективности идентификации риска регионарного метастазирования аденокарциномы желудка с глубокой инвазией при включении в тестирование маркеров, как статистически значимо дискриминирующих T3-4N0M0 и T3-4N1-3M0, так и продемонстрировавших потенциальную информативность для данных целей (согласно данным х2-теста).
Обнаружение в опухоли амплификации по одному из двух маркеров (NFKB, POU5F1B) повышает риск метаста- зирования в регионарные лимфатические узлы почти в 7 раз, но без статистически значимой достоверности в пределах использованной нами выборки (95%CI:0,961-48,51, P>0,05). Добавление локуса HER2 в паттерн маркеров повышает уровень риска метастазирования только в 4 раза, однако это значение относительного риска статистически значимо (95%CI:1,115-16,926, P<0,05). Два из 16-ти исследованных локусов продемонстрировали статистическую значимость для дискриминации групп T3-4N0M0 и T3- 4N1-2M0 — NFKB и HER2 (чувствительность Se-62%; специфичность Sp - 88%). В целом, обнаружение в опухоли амплификации 2 этих локусов повышает риск метастазирования в регионарные лимфатические узлы в 2,2 раза (P<0,001).
Экспрессия белков р53, ki-67, bcl2, Her2/neu в опухолях желудка у пациентов с поражением и без поражения регионарных лимфоузлов
Положительная экспрессия р53 (>25%) в группе без метастазов была выявлена в 20% (6 из 30) пациентов, разброс количества окрашенных клеток при этом находился в пределах от полного отсутствия окрашивания до 15% (рис. 3) клеток, тогда как отрицательная реакция была отмечена в 80 % (24 из 30).
Рисунок 3. Экспрессия р53 в ядрах опухолевых клеток в группе без метастазов (слева) и в группе с метастазами (справа). Ув. Х 40.
Figure 3. p53 expression in tumor cells nuclei in the group without metastases (left) and in the group with metastases (right). (zoom X40).
В группе с метастазами накопление р53 в ядрах клеток встречалось у 40% (12 из 30) пациентов, разброс количества окрашенных клеток при этом находился в пределах от единичного окрашивания до 60% клеток, и в 10% (3 из 30) достиг точки разделения «cut-off» в 25% ядер опухолевых клеток (рис. 3).
Отрицательная экспрессия наблюдалась в 50% случаев (15 из 30). При распределении по критерию χ2 связь между факторным и результативным признаками была статистически значима (5,934> 3,841) при уровне значимости р<0.05. Среднее значение экспрессии р53 в ядрах опухолевых клеток в группе без метастазов было ниже на 52,4% по сравнению с экспрессией данного маркера из группы с метастазами (различия статистически достоверны р<0,05).
Положительная экспрессия bcl-2 в группе без метастазов была обнаружена в 40% случаев (18 из 30), разброс количества окрашенных клеток был небольшим и составлял от 10% и до 30% (рис. 4).
Рисунок 4. Экспрессия bcl-2 в цитоплазме опухолевых клеток в группе без метастазов (слева) и с метастазами (справа). Ув. Х 40.
Figure 4. bcl-2 expression in tumor cells cytoplasm in the group without metastases (left) and with metastases (right). (zoom X40)
Отсутствие окрашивания клеток к маркеру bcl-2 отмечалось в 60% (12 из 30). В группе с метастазами положительная реакция окрашивания к антителам bcl-2 цитоплазмы опухолевых клеток наблюдалась в 53,3% случаев (16 из 30) и разброс составлял от 25% и до 55% (рис.4). Отсутствие окрашивания было отмечено в 46,7% (14 из 30). При распределении по критерию χ2 связь между факторным и результативным признаками была статистически не значима (1,071< 3,841) при уровне значимости р>0.05. Хотя среднее значение окрашенных клеток маркером bcl-2 в группе без метастазов и было ниже на 19%, чем в группе с метастазами, однако разница оказалась статистически недостоверна р>0,05.
При оценке пролиферативного потенциала клеток исследуемых групп было выявлено наличие низкой, умеренной и высокой пролиферативной активности (ПА). В группе без метастазов наблюдалось равномерное распределение пролиферативной активности между пациентами, но все-таки низкая ПА преобладала и была отмечена у 40% (12 из 30) пациентов. Умеренная и высокая пролиферативная активность отмечалась у 33,3% (10 из 30) и 26,7 % (8 из 30) соответственно (рис. 5).
Рисунок 5. Экспрессия ki-67 в ядрах опухолевых клеток в группе без метастазов (слева, низкая) и с метастазами (по центру — умеренная и справа — высокая). Ув. Х 40.
Figure 5. ki-67 expression in tumor cells nuclei in the group without metastases (left, low expression) and with metastases (center — moderate expression and right — high expression). (zoom, X 40).
Рисунок.6. Слабая экспрессия с-erbB-2 (+) на мембранах опухолевых клеток в группе без метастазов и гиперэкспрессия с-erbB-2 (+++) на мембранах опухолевых клеток в группе с метастазами. Ув. Х 40.
Figure 6. Weak expression of c-erbB-2 (+) on tumor cells membranes in the group without metastases and overexpression of c-erbB-2 (+++) on tumor cells membranes in the group with metastases. (zoom, X 40).
В группе же с метастазами максимальное количество опухолей было выявлено с умеренной пролиферативной активностью и отмечалось у 56,7% больных (17 из 30)).
Тогда как высокая ПА была отмечена у 33,3% пациентов (4 из 30), а низкая — всего у 10% больных (3 из 30). Разброс пролиферирующих ki-67 положительных клеток в группе без метастаз находился в пределах от 15% до 60%, в группе с метастазами — от 20% до 70%. Соотношение доли опухолей с низкой ПА к доле опухолей с высокой ПА в группе без метастазов составило 1,5, тогда как в группе с метастазами — 0,3. При распределении по критерию χ2 связь между факторным и результативным признаками была статистически значима (7,437>5,991) при уровне значимости р<0.05.
Отсутствие экспрессии («-» — негативная иммуно- гистохимическая реакция) Her2 в группе без метастазов определялась в 66,7% случаев (20 из 30). Интенсивное окрашивание мембраны раковых клеток («++» — умереннопозитивная иммуногистохимическая реакция) наблюдалось в 20% случаев (5 из 30). В группе с метастазами отрицательная экспрессия с-erbB-2 определялась в 56,7% случаев (17 из 30), где полное отсутствие (-) наблюдалось в 46,7% (14 из 30 пациентов), а слабая мембранная реакция (+) в 10% (3 из 30 пациентов). В данной группе нами была отмечена тенденция к повышению экспрессии с-erbB-2. Так, гиперэкспрессия (++) и (+++) наблюдалась в 43,3 % случаев (13 из 30 наблюдений), из них (++) встречалась в 16,6% (5 из 30), («+++» — сильнопозитивная им- муногистохимическая реакция) — в 26,7% (8 случаев из 30) (рис.8). Хотя разброс количества положительно окрашенных клеток был неоднородным и находился от 10% до более 50%, в основном все-таки преобладал высокий процент окрашивания опухолевых клеток.
При распределении по критерию χ2 связь между факторным и результативным признаками также была статистически значима (5,079> 3,841) при уровне значимости р<0.05. Данные исследования приведены в табл. 3.
Таблица/ Table 3.
Анализ экспрессии с-егЬВ-2 у пациентов исследуемых групп
Analysis of c-erbB-2 expression in patients in the study groups
Экспрессия с-erbB-2с-erbB-2 expression | Группа без метастазов (n=30)Group without metastases (n = 30) | Группа с метастазами (n=30)Group with metastases (n = 30) | χ2 | p | ||
---|---|---|---|---|---|---|
Абс.Absolute | % | Абс.Absolute | % | |||
(-) | 20 | 66,7 | 14 | 46,7 | ||
(+) | 5 | 13,3 | 3 | 10 | ||
(++) | 5 | 20 | 5 | 16,6 | 5,079 | 0.0242 |
(+++) | - | - | 8 | 26,7 | ||
ВсегоTotal | 30 | 100 | 30 | 100 |
Прогнозирование развития метастазов у пациентов с аденокарциномой желудка
На основании статистической обработки полученных выше результатов были выбраны прогностические значения копийности генов и экспрессии белков:
Таким способом было осуществлено прогнозирование вероятности развития метастазов у 30 пациентов с диагностированной аденокарциномой желудка (см. клинические примеры).
1) Больной Р., дата рождения 06.02.1950 г., госпитализирован в отделении абдоминальной онкологии №1 РНИОИ 19.11.2014 г. с верифицированным диагнозом рак желудка, ФГС 09.10.2014 Сancer субкардиального отдела желудка. Атрофический анацидный (РН-5,0) Нр-не ассоциированный гастрит. Дуоденит.
При СРКТ органов грудной клетки, брюшной полости и малого таза 02.10.2014 перигастральных, периинтестинальных образований не выявлено. Легочная ткань — с обеих сторон в легких диффузный пневмосклероз, что позволило предположить до операции стадию II, T3NxM0.
19.11.2014 Лапаротомия, гастрэктомия с расширенной лимфаденкэктомией. При макроскопическом исследовании в удаленном желудке обнаружена опухоль до 6 см в диаметре по малой кривизне, инфильтративно язвенного типа, увеличенные лимфоузлы вдоль левых желудочных сосудов (до 10).
По данным патоморфологического исследования, после операции № 88480-483/14 G2 аденокарцинома с изъязвлением инвазией всей толщи стенки желудка и подлежащей жировой ткани; 88494-503 в 1 из 10 лимфоузлов-метастаз аденокарциномы.
Таким образом, степень распространения процесса, согласно классификации TNM, соответствовала T3N1M0.
Результаты оценки копийности целевых генов и параметров ИГХ в биоптате у данной пациентки: rCNFKB1=0,95 и rCHER2 = 2,6; уровень экспрессии в ядрах опухолевых клеток белка KI67игх = 59,5 и позитивная экспрессия HER2игх (+++), находились в границах прогностического критерия развития метастазов.
2) Больная П., дата рождения 20.05.1960 г., госпитализирована в отделении абдоминальной онкологии №1 РНИОИ 30.06.2015 г. с верифицированным диагнозом рак желудка. ФГДС 17.06.2015 рак антрального отдела желудка, гистологическое исследование № 3284 малодифференцированная аденокарцинома. КТ брюшной полости и забрюшинного пространства 23.06.2015 КТ-признаки диффузных изменений паренхимы печени по типу стеа- тоза, хронического холецистита, густой желчи в полости желчного пузыря, хронического панкреатита, признаков метастатического поражения не выявлено, что позволило предположить до операции стадию II, T3NxM0.
02.07.2015 была выполнена операция: дистальная субтотальная резекция желудка по Бильрот 2 с расширенной лимфаденэктомией. При макроскопическом исследовании в удаленной части желудка обнаружена опухоль в выходном отделе до 6 см в диаметре, инфильтративно- язвенного типа, на разрезе — белесоватого цвета, в большом и малом сальнике увеличенных лимфоузлов не выявлено. По данным патоморфологического исследования после операции №53119-121/15 G2-3 аденокарцинома с инвазией в клетчатку, 53122-7/15 метастазов опухоли в лимфоузлах нет. Таким образом, степень распространения процесса, согласно классификации TNM соответствовала T4aN0M0.
Результаты оценки копийности целевых генов и параметров ИГХ в биоптате у данной пациентки: rCNFKB1 =0,65 и rCHER2 = 1,0; уровень экспрессии в ядрах опухолевых клеток белка Ki 67игх = 26,2 и экспрессия HER2игх негативная (-), находились в границах прогностического критерия отсутствия развития метастазов.
Одной из основных задач исследования CNV в геноме является выявление онкогенов, которые вызывают функциональные нарушения в клетке, способствующие её малигнизации. Согласно литературным данным охарактеризованы изменения копийности множества генов в опухолях различного происхождения. Оценки встречаемости изменения копийности одного и того же гена часто значительно разнятся. Так, приводимые частоты амплификации онкогена HER2, ассоциированной, как правило, с плохим исходом, варьируются от 6 до 23% от числа исследованных случаев рака желудка [
В работе не было обнаружено образцов опухолей с аберрантными rC генов APC и GKN1, что может быть обусловлено как популяционными особенностями нашей группы пациентов, недостаточной численностью выборки для обнаружения достаточно редких событий, так и ограничениями при формировании групп сравнения (отбирали опухоли с инвазией всех слоев желудка — Т3-4).
Ранее обсуждалось снижение числа копий мтДНК, оцениваемое по rC локуса HV2, в различных гистологических типах рака желудка относительно нормальных клеток и по мере потери дифференцировки опухолевыми клетками [
Во многих исследованиях сообщалось о значительном увеличении числа копий гена С-МУС в процессе канцерогенеза [
В целом, выявленные частоты проявления аберрантных CNV в злокачественных опухолях желудка T3-4N0- 3M0 согласуются в большинстве случаев с данными более ранних исследований.
Особую роль при развитии рака желудка играет онкоген HER2, кодирующий тирозинкиназный рецептор. Повышенная экспрессия его белкового продукта стала критерием в молекулярной классификации рака желудка [
Исследование экспрессии белка HER2 продемонстрировало повышенную частоту встречаемости гиперэкспрессии в аденокарциномах с метастазами. Анализ данных ИГХ и rC этого локуса выявил статистически значимую положительную корреляцию (R=+0,828 при P<0,01). Таким образом, в большинстве случаев (80%) амплификация генетического локуса HER2 сопровождалась повышением экспрессии кодируемого им белка HER2.
Патологические изменения апоптоза в малигнизированных клетках играют важную роль в накоплении генетических клеточных повреждений, ответственных за развитие опухолевой прогрессии. При этом опухолевые клетки получают возможность выживать без наличия экзогенных факторов роста, становятся устойчивыми к гипоксии, активизируют пролиферативные процессы, в них нарушается дифференцировка, клетки стимулируют ангиогенез, приобретают клеточную подвижность и инвазивный рост. Нарушения апоптоза активируют метастазирование, позволяя отдельным эпителиальным клеткам выживать вне связи с внеклеточным матриксом. Таким образом, патология апоптоза является фундаментальной причиной возникновения злокачественных опухолей.
Ключевыми белками, участвующими в управлении апоптозом, являются белки семейства bcl-2 и супрессор опухолевого роста р53.
В норме ген р53 осуществляет защиту генома. Нарушения процессов апоптоза наступают в том случае, если ген р53 теряет свои функции. Это может произойти в условиях патологии, когда в результате мутации гена p53 образуется его мутантный аналог — mt p53. Мутация p53 приводит к нарушению внутриклеточных механизмов регуляции клеточного цикла и не дает реализоваться апоптозу, чем способствует опухолевому росту [
Анти-апоптозный онкоген bcl-2 является независимым прогностическим и предсказательным признаком, ведущим геном, определяющим механизм клеточной смерти, подавляя апоптоз. Этот ген кодирует образование белка, накапливающегося в митохондриях, что при иммуногистохимической реакции находит отражение в пятнистой окраске цитоплазмы. Основным механизмом действия bcl-2 считается инактивация проапоптотических гомологов семейства bcl-2 путем димеризации с ними и, как следствие, подавление выхода из митохондрий цитохрома С, необходимого для активации каспаз [
Универсальным маркером для оценки клеточного цикла является белок Ki-67, по экспрессии которого можно исследовать пролиферативную активность клеток. Антитела к Ki-67 выявляют пролиферирующие клетки, находящиеся в разных фазах цикла. Это наиболее надежный и четкий маркер пролиферации [
Среднее значение экспрессии Ki-67 в группе без метастазов было ниже на 34,3%, по сравнению с экспрессией данного маркера в группе с метастазами, разница значений статистически достоверна (р<0,05). Проведенное ИГХ (исследование пролиферативного потенциала опухолей исследуемых групп) выявило преобладание опухолей с низкой пролиферативной активностью в группе без метастазов в 4 раза по сравнению с группой с метастазами. Умеренная и высокая пролиферативная активность встречалась чаще у больных в группе с метастазами в 1,7 раз и 1,2 раза соответственно.
Проведенное исследование показало, что относительная копийность исследованных генетических локусов в опухолях желудка разных N-типов изменяется неодинаково. Были выявлены характерные для аденокарцином T3-4N1-3M0 набор и частота аберрантных rC — амплификация онкогенов NFKB и HER2. Этот паттерн, характерный для аденокарцином T3-4N1-3M0, может рассматриваться как неблагоприятный прогностический признак в отношении формирования метастазов в регионарных лимфатических узлах. В большинстве случаев (80%) амплификация генетического локуса HER2 сопровождается повышением экспрессии белка HER2 (P<0,01), что подтверждает валидность использованной экспериментальной модели.
В результате исследования пролиферативного потенциала опухолей исследуемых групп выявлено преобладание опухолей с низкой пролиферативной активностью в группе без метастазов в 4 раза, по сравнению с группой с метастазами. По результатам исследования сформирован алгоритм прогнозирования развития метастазов при аденокарциноме желудка.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.