Неблагополучная эпидемиологическая обстановка по холере в мире обусловливает риски завоза данной инфекции на территорию любого субъекта Российской Федерации (РФ) с вероятностью распространения посредством водного фактора передачи. Контаминация холерными вибрионами водных объектов окружающей среды (ООС) — поверхностных водоёмов и сточных вод — свидетельствует об их эпидемиологической опасности [1][2]. В рамках эпидемиологического надзора за холерой на территории РФ1 проводятся мониторинговые обследования ООС с целью своевременного обнаружения нетипичных для неэндемичной территории России эпидемически значимых (токсигенных) штаммов холерных вибрионов О1, О139 серогрупп. Кроме того, в ходе указанного мониторинга также выделяются эпидемически не значимые (нетоксигенные) штаммы. Анализ результатов мониторинговых исследований, проведённых на территориях разных субъектов РФ за разные временные периоды, позволяет судить об эпидемиологической обстановке по холере, о прогнозе её развития и о потенциальном эпидемиологическом риске распространения инфекции водным путем в случае завоза токсигенного штамма [1][3–7]. Вместе с тем, особое значение приобретают динамичный мониторинг с расширением временных границ и использование современных методов анализа для углубленного изучения выделенных культур холерных вибрионов.

В этой связи представляло интерес проследить динамику выделения  культур холерного вибриона за более чем тридцатилетний период и дать характеристику биологических свойств штаммов Vibrio cholerae О1, О139, изолированных из водных объектов окружающей среды г. Ростова-на-Дону — территории, относящейся к территориям I типа по эпидемическим проявлениям холеры.2

Цель исследования — ретроспективный анализ результатов мониторинговых исследований водных объектов окружающей среды г. Ростова-на-Дону на наличие холерных вибрионов в период с 1989 г. по 2023 г. по стационарным точкам отбора проб, закреплённым за ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, выявление тенденций и особенностей динамики выделения и биологических свойств изолированных штаммов.

В период с 1989 г. по 2023 г. были исследованы 4362 пробы из водных ООС г., из них 3981 (91,3%) — пробы воды из поверхностных водоёмов, и 381 (8,7%) составляли пробы из сточных вод. Организацию и проведение исследований осуществляли в соответствии с нормативно-методическими документами3. Пробы воды поверхностных водоёмов, охватывающих основные эпидемиологически значимые водоемы города (реки Дон, Темерник, Мертвый Донец), а также из сточных вод после очистки и обеззараживания на очистных сооружениях города перед сбросом в реку Дон отбирали еженедельно с мая по сентябрь в период с 1989 г. по 2021 г. и с апреля по октябрь в 2022 г. и 2023 г. Отбор проб осуществляли в стационарных точках отбора, закреплённых за ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора. За анализируемый период количество стационарных точек колебалось от шести до девяти. Кроме того, по эпидпоказаниям проводились исследования и по дополнительным точкам отбора проб.

Выделение и идентификация холерных вибрионов проводили с использованием бактериологических, серологических и молекулярно-биологических методов исследований4. Секвенирование изолированных штаммов проводилось на платформе MiSeq (Illumina)  с получением ридов длиной 250 п.н. c использованием набора реагентов nextera DNA flex library prep (Illumina). Сборка геномов исследуемых штаммов была выполнена с помощью SPAdes (v.3.11.1) [8]. Генетические детерминанты идентифицировали в полногеномных сиквенсах с помощью программ BioEdit 7.2.5 (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit) и BLASTN 2.2.29 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

Статистическую обработку данных исследования проводили с помощью компьютерной программы «STATISTIKA» (StatSoftRussia) и с использованием параметрических методов. Результаты исследований считали достоверными при вероятности безошибочного прогноза Р > 0,95 или р < 0,05.

Всего за анализируемый период из водных объектов г. Ростова-на-Дону были выделены и идентифицированы 122 штамма V. cholerae O1 и О139 серогрупп. Так, за период с 1989 г. по 1998 г. был выделен только один (0,8%) штамм V. cholerae O1. Начиная с 1999 г. по 2008 г. включительно, штаммы выделялись ежегодно с нарастающей количественной динамикой  — 41 штамм (33,6%). С 2009 г. по 2018 г. за исключением трёх лет (2011, 2012 и 2017 гг.) штаммы выделялись ежегодно. За указанный период наблюдалось уменьшение количества выделенных штаммов  — 28 (23,0%). С 2019 г. по настоящее время выделение V. cholerae О1 вновь возобновилось с ежегодным нарастанием количества обнаруживаемых штаммов. В итоге за указанный период было изолировано 52 штамма (42,6%). Линия тренда демонстрирует стойкую тенденцию увеличения количества выделяемых штаммов V. cholerae O1 и О139 серогрупп из воды водоёмов и из стоков на территории г. Ростова-на-Дону за анализируемый период (рис. 1).

В среднем в течение года выделялось 4,0 ± 0,8 штаммов.

Большинство штаммов обнаружено в поверхностных водоемах. Так, из реки Дон изолированы 54 штамма (44,0 %), а из реки Темерник выделены 50 штаммов (41,0 %), из протока реки Мертвый Донец — 13 (11,0 %). Из сточных вод было выделено пять штаммов (4,0 %). По среднемноголетним данным наибольшее число штаммов было обнаружено в пробах из водных объектов в июле и в августе месяцах (35 штаммов — 28,7 %,  44 штамма — 36,1 %, соответственно) (рис. 2).

Наибольшее количество штаммов V. cholerae О1/О139 было обнаружено в пробах воды из стационарных точек №4 («река Дон, Правый берег у железнодорожно-автодорожного моста “Западный обход”» и № 6 («река Темерник, Ботанический сад, у моста, сброс сточных вод») (рис. 3).

Относительно фено- и генотипических характеристик изолированных культур следует отметить, что в результате идентификации была подтверждена их принадлежность к виду V. cholerae по таксономическим признакам и определены особенности биологических свойств. Так, из 122 изолированных штаммов холерного вибриона 119 (97,5%) были отнесены к V. cholerae O1, а три (2,5%) — к О139 серогруппы. В водных объектах г. Ростова-на-Дону, начиная с 2000 г., штаммы О139 серогруппы не обнаруживались. К биовару El Tor принадлежало 118 штаммов, а к биовару сlassical — один штамм, выделенный в 1999 г. из реки Дон. Из 118 штаммов V. cholerae O1 El Tor 96 штаммов (80,7%) относились к серовару Огава, 21 штамм (17,8%) — к серовару Инаба и два (1,7%) — к серовару Гикошима. С 2009 г. по 2023 г., среди выделенных штаммов V. cholerae О1, штаммы серовара Гикошима отсутствовали (табл.).

Большинство штаммов V. cholerae O1 — 102 штамма (83,6%) — были резистентными к холерным диагностическим фагам. Чувствительными к фагу «Эль Тор» оказались 18 (14,7 %)

штаммов, к фагу «С» — два (1,7 %). Принадлежность к определённому фаготипу удалось установить лишь у 22 (18,6 %) из 118 штаммов V. cholerae O1 El Tor. При этом наиболее распространёнными фаготипами были 15 (9 штаммов) и 16 (5).

Изолированные штаммы V. cholerae O1 различались по эпидемической значимости. Среди них восемь (6,7%) относились к эпидемически значимым (токсигенным – ctxАВ+ tcpА+). Эти штаммы были изолированы из водных объектов окружающей среды в 1999 г., 2000 г., 2001 г., 2003 г., 2011 г., 2014 г., 2023 г. (табл., рис. 4).

Проведённое секвенирование и результаты биоинформационного анализа токсигенных штаммов показали, что штаммы с генетической характеристикой ctxАВ+ различались по структуре субъединицы В холерного токсина. Так, геном штамма V. cholerae classical (1999 г.) содержал субъединицу В1 классического типа, а штамм V. cholerae El Tor (2000 г.) содержал аллель ctxB3 типа El Tor.  В то же время, в геномах штаммов V. cholerae El Tor (2001 г., 2003 г., 2014 г., 2023 г.) выявлена замена аллеля ctxB3 на ctxB1.

Анализ динамики выделения штаммов холерных вибрионов О1, О139 серогрупп в г. Ростове-на-Дону за изучаемый период свидетельствовал о стабильном росте количества выделяемых штаммов с конца 80-х гг. прошлого века, что свидетельствует о нарастающей контаминации водных объектов и об усиливающихся рисках распространения холеры водным путем в случае заноса инфекции. В обнаружении штаммов отмечается летняя сезонность, характерная для этих микроорганизмов. Штаммы холерных вибрионов обнаруживали во всех эпидемиологически значимых водоёмах города и в пробах воды из всех стационарных точек отбора. Сохранилась тенденция, отмеченная в период 1989–2018 гг. [7], количественного распределения штаммов по водоёмам, из проб которых они были изолированы. Анализ распределения штаммов холерных вибрионов по стационарным точкам отбора проб также показал, что количество выделенных штаммов из стационарных точек, расположенных по течению рек Темерник и Дон, было практически одинаково. Штаммы V. cholerae О139 не обнаруживались в течение последних 23 лет, что, по-видимому, свидетельствует о снижении персистентного потенциала.

При анализе распределения штаммов V. cholerae О1 серогруппы, изолированных из водных объектов г. Ростова-на-Дону, было выявлено, что основное их количество выделено из поверхностных водоемов — 117 штаммов, обнаружение которых регистрировалось практически ежегодно за весь анализируемый период с тенденцией к увеличению. Из сточных вод было выделено пять штаммов V. cholerae О1 серогруппы в период с 1989 г. по 2008 г., но в последующие годы штаммы холерных вибрионов в данных водных объектах не обнаруживались (табл.).

Среди восьми токсигенных штаммов были выявлены генетически не измененные  — V. сholerae classical (1999 г.), а также штамм V. сholera О1 El Tor (2000 г.), содержащий аллель ctxB3, который в соответствии с данными Монаховой Е.В. с соавт. (2020) был обозначен как «прототипный», а остальные токсигенные штаммы V. сholera О1 El Tor являлись представителями «первых геновариантов», отличавшихся от прототипных только заменой аллеля ctxB3 на ctxB1. Несмотря на то, что основное количество токсигенных штаммов холерных вибрионов, циркулирующих в мире в настоящее время, относятся к «гаитянской» либо «постгаитянской» В7 группе [1][9][10], токсигенный штамм, выделенный в 2023 г. из воды реки Темерник, также принадлежал к «первым геновариантам». Обнаружение токсигенных штаммов в водных объектах на фоне эпидемического благополучия по холере можно расценивать как неустановленный завоз из Азиатских регионов, где такие клоны регистрируются.

Такое событие следует рассматривать как реальный риск осложнения эпидемической ситуации по холере в г. Ростове-на-Дону. Необходимо проведение тщательного эпидемиологического расследования с целью установления источника контаминации ООС и выявления рисков распространения холеры, обусловленных водным путём передачи возбудителя. Кроме того, имеется основание прогнозировать вероятность завоза инфекции в среднесрочной и долгосрочной перспективе.

Подавляющее большинство штаммов было идентифицировано как эпидемически не значимые (нетоксигенные — ctxАВ-tcpА+ и ctxАВ-tcpА-). Вместе с тем такие штаммы могут вызывать спорадические заболевания или вспышки с клиническими проявлениями гастроэнтерита за счёт экспрессии генетических детерминант целого ряда факторов патогенности. Следует отметить, что нетоксигенные штаммы, выделенные из водоёмов г. Ростова-на-Дону, сформировывали клональные комплексы, представители которых способны к сохранению и распространению в водных объектах. В геномах этих штаммов содержался остров патогенности VPI c кластером генов TCP — ключевого фактора адгезии холерных вибрионов [9]. Их многолетнее обнаружение свидетельствует об усиливающемся риске подключения водного фактора к распространению инфекции, что требует проведения мероприятий по установлению источника контаминации для снижения риска возможного распространения холеры водным путём в случае завоза токсигенного штамма и осложнения эпидемической ситуации по холере в г. Ростове-на-Дону.

Проведённый ретроспективный анализ динамики контаминации V.cholerae основных эпидемиологически значимых водных объектов окружающей среды г. Ростова-на-Дону и биологических свойств штаммов, изолированных в ходе мониторинга с 1989 г. по 2023 г. показал следующее:

1. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» 2. МУК 4.2.3746-22 «Организация и проведение лабораторной диагностики холеры в лабораториях различного уровня» 3. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» 4. МУК 4.2.3745-22 «Методы лабораторной диагностики холеры»