В процессе жизнедеятельности у всех грамотрицательных бактерий образуются везикулы наружных мембран (OMVs) — сферические структуры диаметром от 20 до 300 нм [1][2]. Установлено, что молекулы белковой и липополисахаридной природы, расположенные на наружной мембране микроба, являются мишенями для компонентов врождённого (неспецифического) иммунитета, а также проявляют свойства протективных антигенов и участвуют в формировании специфического антибактериального иммунитета [3]. Поэтому исследования по изучению иммуногенных и протективных свойств везикул наружных мембран различных возбудителей активно ведутся во всём мире. Для профилактики менингококковой инфекции, вызываемой Neisseria meningitidis серогруппы В, лицензирована и успешно используется в клинической практике вакцина Bexsero (Италия), состоящая из везикул наружных мембран [3]. В литературных источниках приводятся доказательства формирования эффективного иммунитета к различным бактериальным инфекциям при использовании вакцинных препаратов на основе везикул наружных мембран Escherichia coli [4], Neisseria gonorrhoeae [5], Burkholderia pseudomallei [6], Salmonella typhimurium [7], Helicobacter pylori [8], Neisseria meningitidis [9], Brucella abortus [10], Klebsiella pneumoniae [11], Bordetella pertussis [12] и т.д.

Показано, что везикулярные вакцины имеют ряд важных преимуществ: они безопасны, но обладают свойствами целой бактериальной клетки, антигены на их поверхности находятся в нативном состоянии. Кроме того, они не требуют холодовой цепи и буферного раствора, что делает их применение экономически выгодным и перспективным [13].

Как и все грамотрицательные бактерии, холерные вибрионы способны выделять везикулы наружных мембран — образования сферической формы от 20 до 200 нм, которые транспортируют различные факторы вирулентности возбудителя, в том числе и холерный токсин (ХТ), к клеткам эпителия тонкого кишечника [14–16].

Об эффективности использования OMVs холерного вибриона в качестве средства специфической профилактики холеры свидетельствуют эксперименты, проведённые зарубежными учеными. Так S. Schild с соавт. [17] обнаружили у мышей, рождённых от матерей, иммунизированных препаратами OMVs токсигенных штаммов Vibrio cholerae E7946 O1 El Tor Inaba и V. cholerae O395 O1 Ogawa, наличие противохолерных иммуноглобулинов (Ig) класса G в количестве, достаточном для полной защиты новорождённых от колонизации холерных вибрионов, что свидетельствовало о возможности передачи пассивного гуморального иммунитета к возбудителю холеры. При этом в фекалиях иммунизированных самок регистрировались специфические IgA и IgG1, подтверждающие индукцию иммунного ответа в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ). Интересно, что включение в состав OMVs холерных вибрионов гетерологичного антигена (периплазматической щелочной фосфатазы E. coli) и последующая интраназальная иммунизация ими индуцировала у мышей специфический иммунный ответ против гетерологичного антигена. Полученные данные свидетельствуют о потенциальной возможности использования везикул для доставки различных антигенов при разработке новых вакцин [17]. N. Roy с соавт. [18] было выявлено, что OMVs V. cholerae значительно менее реактогенны, чем живые и убитые при нагревании бактерии, а пероральная иммунизация такими препаратами может индуцировать долгосрочный иммунитет. A.L. Bishop с соавт. [19] выявили, что иммунизация мышей везикулами наружных мембран холерных вибрионов О1 серогруппы Инаба или Огава обеспечивает защиту тонкого кишечника животных от колонизации V. cholerae О1 обоих серотипов. Этими же авторами показано, что OMVs V. cholerae O1 или O139 серогрупп не обеспечивают перекрёстную серогрупповую защиту, а использование смеси везикул наружных мембран, выделенных от холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп, обеспечивают защиту животных от заражения этими штаммами. Другими учеными обнаружено [20], что введение OMVs V. cholerae или энтеротоксигенной кишечной палочки (ETEC) вызывало формирование видоспецифичного иммунитета, а комбинации везикул этих бактерий — высокого иммунного ответа против обоих патогенов.

R.  Sinha с соавт. [21] создали экспериментальную противохолерную вакцину (CPMVs), смешав везикулы наружных мембран пяти вирулентных штаммов V. cholerae. Показано, что четырёхкратная пероральная иммунизация CPMVs индуцировала у мышей специфические В- и Т-клеточные реакции, выработку сывороточных противохолерных антител класса G, A, M, sIgA на слизистых оболочках, а также секрецию цитокинов, характерных для Th2 и Th17 иммунных ответов. Иммунизированные этой вакциной взрослые мыши и их потомство были защищены от заражения вирулетными штаммами V. cholerae.

M. Sedaghat и соавт. [22] продемонстрировали, что пероральная вакцинация мышей OMVs и, особенно, в комбинации с клиническим штаммом V. cholerae, выделенным от больного холерой (WC-OMVs), обеспечивает защиту от заражения вирулентными штаммами холеры. Наибольшая эффективность WC-OMVs, по мнению авторов, может быть связана либо с увеличением количества протективных антигенов, либо с адъювантными свойствами везикул.

Таким образом, все вышеизложенное свидетельствует о возможности применения везикул наружных мембран для специфической профилактики холеры. Однако экспериментальные разработки, касающиеся создания вакцин на основе OMVs холерных вибрионов, были проведены с использованием вирулентных штаммов V. cholerae. Работа с такими штаммами требует особого режима с соблюдением усиленных мер безопасности, что затрудняет получение вакцинных препаратов. Кроме того, в везикулах, полученных из токсигенных штаммов, может находиться ХТ —основной фактор патогенности возбудителя холеры. Показано, что большая часть ХТ секретируется в OMV-ассоциированной форме и находится исключительно внутри везикул [16]. В отличие от свободного ХТ, секретируемого через систему секреции II типа, OMV-ассоциированный ХТ защищен от деградации кишечными протеазами, что позволяет ему дольше находиться в кишечном тракте и сохранять токсичность [15].

Цель исследования — оценка эффективности и целесообразности применения везикул наружных мембран атоксигенных штаммов V. cholerae О1 серогруппы для профилактики экспериментальной холеры.

Для получения препаратов везикул использовали штаммы V. cholerae О1 El Tor 18950 (ctxAВ-tcpA-), 18780 (ctxAВ-tcpA+), выделенные из воды поверхностных водоёмов. Культуры выращивали при 37˚С 18 часов на агаре Мартена (рН 7.6). Из суточной агаровой культуры делали 1 млрд взвесь по стандарту мутности в 3 мл физиологического раствора (рН 7.8) и 0,5 мл взвеси засевали в 25 мл бульона LB. Штаммы культивировали с дополнительной аэрацией (шуттелированием) 120–130 качаний в минуту на шуттеле (Incubator shaker, serious 25, США) 18 часов при 37˚С. Из выросшей культуры засевали по 0,5 мл в 4 флакона среды LB по 250 мл и выращивали 18 часов с аэрацией.

После обеззараживания мертиолятом натрия 1:10000 культуру, выращенную в питательной жидкой среде, центрифугировали при 6000 об./мин. 25 минут на холоде на центрифуге (Веckman, model J2-21, США). Полученные надосадки попеременно фильтровали через мембраны с диаметром пор 0,45 мкм и 0,22 мкм. Концентрировали препараты в 10 раз на ультрафильтрационной установке (Amicon) с последующим центрифугированием образцов при 45000g в течение 2 часов. Для дальнейшего исследования осадок растворяли в 500 мкл физиологического раствора (рН 7.8). Количество белка в полученных препаратах составляло 400–500 мкг/мл. Детекцию белка проводили на приборе (Bio Rad). Готовые препараты хранили при -20˚С.

Наличие везикул в препаратах подтверждали методом ТЭМ с помощью электронного цифрового микроскопа Jeol JEM 1011. Все манипуляции выполняли согласно МУ 1.3.3103–13 [23]. Было обнаружено присутствие сферических везикул размерами около 40–200 нм.

Оценка специфической стерильности препаратов с помощью бактериологического метода показала их биологическую безопасность.

Анализ белков препаратов везикул осуществляли в ПААГ-электрофорезе в присутствии SDS по методике U.K. Laemmli [24]. Наличие липополисахарида (ЛПС) в составе препаратов везикул определяли методом прямого варианта иммуноферментного анализа (ИФА), который осуществляли общепринятым методом в 96-луночных плоскодонных серологических планшетах (Costar) [25].

Протективную способность полученных везикул наружных мембран оценивали на модели белых мышей (16–20 г в возрасте 6–10 недель) и на модели взрослых кроликов (1,5–2 кг). При работе с экспериментальными животными руководствовались международными принципами, изложенными в «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей» ETS N 123 (Страсбург, 1986), Приказом Минздрава РФ от 01.04.2016 № 199Н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики». На все эксперименты получено положительное заключение Комиссии по биоэтике при ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, протокол заседания №2 от 17.01.2022 г.

Белых мышей иммунизировали парентерально (внутримышечно) однократно и двукратно (с интервалом в семь дней) полученными препаратами OMVs в дозе 2,5 и 5 мкг белка. Контрольным животным вводили физиологический раствор в том же объёме (0,2 мл) и по той же схеме. Через две недели после последней иммунизации у опытных и контрольных животных вызывали генерализованную форму холеры [26]. Результаты эксперимента учитывали только при гибели всех контрольных животных в течение суток.

Также защитное действие препаратов везикул оценивали на модели взрослых кроликов. Животных иммунизировали парентерально (внутримышечно) однократно и двукратно (с интервалом в семь дней) препаратами везикул по 150 мкг белка в объёме 0,5 мл. Контрольным кроликам вводили физиологический раствор в том же объёме и по той же схеме. Протективную активность препаратов изучали с помощью модели перевязанной петли тонкого кишечника взрослых кроликов [27]. О развитии экспериментальной холеры судили по наличию холерогенного и энтеропатогенного эффектов в опытной петле тонкого кишечника. Об энтеропатогенном эффекте свидетельствовали развитие отёка слизистой и подслизистой оболочек, кровоизлияния и некроза покровного эпителия ворсин кишечник, о холерогенном — растянутая опытная петля (в результате выпота тканевой жидкости и электролитов в просвет кишечника). Наличие/отсутствие холерогенного эффекта определяли, расчитывая коэффициент растяжения петли по формуле

Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием Мicrosoft Ехсеl 2010 и StatSoft Statistica Windows 10.01. Эксперименты проводили в трёх повторностях, после чего определяли значения доверительных интервалов среднеарифметического (М) для уровня достоверности (Р) 95%. Проводили сравнение совокупностей по качественным признакам с помощью критерия Фишера. Отличия считали значимыми при p<0,05.

Проведена оценка наличия на мембране выделенных везикул основных протективных антигенов — белков и ЛПС. Показано, что в препаратах, полученных из штаммов V. cholerae O1 18950 и 18780, присутствуют белковые полосы на уровне маркера молекулярной массы 40 и 45 кДа в первом препарате и 38 и 40 кДа во втором, что соответствует молекулярному весу белков наружной мембраны, относящимся к семейству омптинов (пориновым белкам наружной мембраны OmpT, OmpU). Также в этих двух препаратах была выявлена минорная полоса около 66,2 кДа. Наличие ЛПС, согласно результатам проведённого ИФА, подтверждено во всех исследуемых препаратах везикул.

При изучении протективности полученных препаратов везикул в тесте активной защиты мышей выявлено, что однократная иммунизация OMVs V. cholerae O1 El Tor 18950 и V. cholerae O1 El Tor 18780 недостаточно эффективно защитила животных от гибели после заражения вирулентными штаммами холеры как при использовании иммунизирующей дозы 2,5 мкг, так и 5 мкг (табл. 1).

Двукратная иммунизация везикулами V. cholerae в дозе 2,5 мкг достоверно способствовала увеличению защитной эффективности препаратов, предотвращая гибель около 50% животных в группе, получавших везикулы штамма V. cholerae O1 El Tor 18950, и около 45 % мышей, иммунизированных препаратом OMVs V. cholerae O1 El Tor 18780.

Лучшие результаты на этой экспериментальной модели получены нами при двукратном применении препаратов в дозе 5 мкг. Данная схема обеспечивала выживаемость 100% белых мышей из группы примированных OMVs V. cholerae O1 El Tor 18950 и практически всех животных, вакцинированных везикулами V. cholerae O1 El Tor 18780 (табл. 1)

Анализ результатов профилактической эффективности изучаемых везикул V. cholerae О1 El Tor 18950 и V. cholerae О1 El Tor 18780 на модели взрослых кроликов показал, что однократное введение препаратов в дозе 150 мкг не защищало животных от развития симптомов холеры в тонком кишечнике, как и в случае однократного применения препаратов при моделировании генерализованной формы холеры у мышей.

Увеличение протективной активности было зарегистрировано нами только после двукратной иммунизации животных. У кроликов опытных групп в опытной и контрольной изолированных петлях тонкого кишечника отсутствовали энтеропатогенный и холерогенный эффекты (К<1,0). При этом у животных контрольной группы опытные петли были растянуты жидкостью (холерогенный эффект) и наблюдались отёк более глубоко лежащих тканей, кровоизлияния и некрозы покровного эпителия ворсин (энтеропатогенный эффект) (табл. 2).

Результаты проведённых экспериментов свидетельствуют о том, что везикулы, выделенные из атоксигенных штаммов холерных вибрионов, обладают протективной способностью и защищают животных от развития экспериментальной холеры. Наибольшую эффективность полученные препараты в изученных дозах проявляют при двукратном парентеральном введении, предотвращая гибель всех взятых в эксперимент белых мышей и развитие патогенетических процессов в тонком кишечнике взрослых кроликов.

Полученные данные подтверждаются нашими предыдущими исследованиями, посвящёнными изучению протективной активности наружных мембран холерных вибрионов, выделенных из атоксигенных штаммов V. cholerae. Было выявлено наличие иммуногенной и протективной активности у наружных мембран холерного вибриона, выделенных щадящими методами из штамма V. cholerae El tor 18950 (ctx-, tcp-, OmpT+, OmpU-, OmpW+). Двукратная иммунизация белых мышей (по 10 мкг) и взрослых кроликов (по 700 мкг) этим препаратом предотвращала развитие холеры у экспериментальных животных, заражённых вирулентными штаммами возбудителя, причём этот эффект сохранялся до пяти месяцев поствакцинального периода (срок наблюдения) [28]. Показано, что наличие защитной способности штамма V. cholerae O1 El Tor 18950 было обусловлено повышенной продукцией на его мембране белка OmpT, обладающего высокой иммуногенностью и протективностью [29]. Полученные в рамках данной работы везикулы наружных мембран, в том числе и из этого штамма, обладали хорошим защитным эффектом при гораздо более низких дозах (5 мкг/мышь и 150 мкг/кролик). Это свидетельствует о сохранении нативной структуры основных протективных антигенов — ЛПС и белков наружной мембраны, входящих в состав везикул [13], — и обеспечивает им большую протективную способность по сравнению с препаратами наружных мембран.

В отличие от зарубежных авторов, получавших экспериментальные препараты везикул из вирулентных штаммов холерных вибрионов [17–22], что требует соблюдения особых мер безопасности и контроля токсичности препаратов из-за наличия в них ХТ как основного фактора патогенности холерного вибриона, нами выделены OMVs из авирулентных (атоксигенных) штаммов холерных вибрионов и показано их протективное действие при экспериментальной холере. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования этих везикул для специфической профилактики холеры и могут быть полезны при разработке новых вакцинных препаратов против этой инфекции.