Инфицирование вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска (ВПЧ ВКР) на сегодняшний день является доказанным, наиболее значимым фактором риска цервикальных интраэпителиальных неоплазий (CIN) и неотъемлемым компонентом её прогрессирования в инвазивный плоскоклеточный рак. При высоком уровне частоты заражения вирусом папилломы человека в течение жизни (80%) около 83% инфекций — преходящие, развитие интраэпителиальной неоплазии будет зарегистрировано только у 5–10% инфицированных женщин, а рак шейки матки (РШМ) разовьётся менее, чем у 1%.

В настоящее время исход CIN (особенно цервикальной интраэпителиальной неоплазии шейки матки легкой степени (LSIL)) трудно предсказать, в связи с чем зачастую неоправданное применение активной хирургической тактики цервикальных интраэпителиальных поражений, способных самостоятельно регрессировать, приводит к ряду неблагоприятных последствий для репродуктивного здоровья. Бесплодие, невынашивание беременности, преждевременные роды, недостаточность шейки матки и кесарево сечение при последующих беременностях определяют непрекращающийся поиск эпигенетических факторов, которые могут служить прогностическими маркёрами риска прогрессирования CIN.

Метилирование дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в положении С5 цитозинового основания в составе CpG-динуклеотидов — доказанный основной эпигенетический механизм, нарушения которого регистрируются уже на ранних стадиях канцерогенеза и являются важным этапом в прогрессии неоплазии. Имея эпигенетическую природу, эти нарушения запускают изменения в экспрессии генов, но, не затрагивая нуклеотидной последовательности ДНК и не приводя к структурным изменениям генома, потенциально обратимы [1,2].

Известно, что персистенция ВПЧ ВКР и прогрессия CIN от легкой до тяжёлой степени, развитие РШМ зависят от метилирования ДНК самого вируса. Полноценный процесс метилирования ДНК ВПЧ ВКР после внедрения в клетку цервикального эпителия определяет ряд важнейших протективных эффектов, таких как ингибирование синтеза онкобелков Е6 и Е7, что способствует подавлению процессов клеточной пролиферации, поддержку апоптоза малигнизированных клеток, повышение синтеза интерферона, поддержку защитных регуляторных механизмов репарации ДНК и стабилизацию генома в конечном итоге [3].

Гипометилирование мобильных ДНК в геноме человека запускает активацию транскрипции, что доказано при изучении эпигенетики ряда многих злокачественных новообразований. Нарушение метилирования ДНК в клетках в результате снижения количества метильных групп коррелирует со степенью злокачественности опухоли и является одним из наиболее ранних событий в многоступенчатом процессе канцерогенеза в молочной железе, шейке матки, яичниках, головном мозге [3–6].

В современной акушерской профессиональной и научно-популярной литературе широко освещена высокая эффективность фолиевой кислоты и витамино-минеральных комплексов, содержащих витамин В9, в первичной профилактике дефектов нервной трубки плода при их применении в периконцепционном периоде [7–9].

Среди исследований последних лет научный и практический интерес представляют данные о наличии взаимосвязи между сывороточным уровнем фолиевой кислоты и различными онкологическими заболеваниями [10–14].

Связь между недостаточностью фолатов и риском развития рака различных локализаций продемонстрировали результаты метаанализа, опубликованного в 2015 г. [15]. Имеются сведения, что дефицит фолатов в сочетании с полиморфизмом метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) ассоциируется с большей частотой колоректального рака [16] и рака молочной железы [17].

Несмотря на доказанную взаимосвязь нарушений процесса метилирования ДНК с канцерогенезом, его причины и конкретные механизмы являются предметом дальнейших исследований и дискуссий. В частности, широко обсуждается вопрос о новых подходах к лечению злокачественных новообразований путём демитилирования генов-супрессоров опухолевого роста с последующей их реактивацией [18].

Вопрос о возможности снижения риска прогрессии с LSIL ассоциированных с ВПЧ ВКР путём коррекции сывороточного уровня фолиевой кислоты остается малоизученным.

В проводимое нами исследование включены 90 пациенток с различными исходами динамического наблюдения LSIL, ассоциированного с одним из типов ВПЧ ВКР (16, 18, 33). I группа — 43 пациентки с регрессом заболевания (нормализация результатов цервикального мазка (NILM) на фоне элиминации ВПЧ ВКР или снижения уровня вирусной нагрузки до клинически-малозначимого (менее 103 геномных эквивалентов ВПЧ ВКР), нормализацией визуального состояния шейки матки по данным кольпоскопического исследования (табл. 1).

II группа представлена 30 пациентками с персистенцией ВПЧ-инфекции, у которых по прошествии 6 месяцев наблюдения сохранялись изменения цитологии цервикального эпителия в пределах LSIL, отмечался прежний уровень вирусной нагрузки (p=0,571, χ2=1,122), отсутствовали статистически значимые изменения в количестве баллов МКИР (табл. 2).

III группу составили 17 больных с прогрессией LSIL, характеризовавшейся цитологическими изменениями цервикального эпителия до HSIL, положительным тестом двойного окрашивания коэкспрессии р16ink4α/Ki-67 по результатам иммуноцитохимического исследования, статистически значимым ростом вирусной нагрузки (p<0,001, χ2=39,192), увеличением количества баллов МКИР (p<0,01, χ2=52,41) (табл. 4).

Предыдущими исследованиями, проведёнными на кафедре акушерства и гинекологии №3 ФГБОУ ВО РостГМУ Минздрава России установлена прогностическая значимость ряда анамнестических параметров и дефицита сывороточного уровня фолиевой кислоты, совокупность которых можно использовать в качестве предикторов прогрессии исхода заболевания [19]. Полученные результаты положены в основу разработки способа прогноза прогрессии LSIL (Патент РФ №2766719 опубликован 15.03.2022) [20].

Для удобства применения разработанного способа в клинической практике разработана компьютерная программа, позволяющая автоматически рассчитывать числовое значение индекса риска прогрессии (ИРП). При величине ИРП <1 риск перехода LSIL в более тяжёлую форму заболевания «низкий» возможно дальнейшее наблюдение в соответствии с клиническими рекомендациями. При значении ИРП >1 риск прогрессии расценивают как «высокий», а дальнейшее динамическое наблюдение, регламентированное клиническими рекомендациями [21], необходимо дополнить верификацией этиологии фолатного дефицита и его коррекцией.

Все пациентки с сывороточными концентрациями фолиевой кислоты, выходящими за пределы референсных значений (табл. 1), были консультированы профильными специалистами для уточнения генеза недостаточного уровня витамина В9 (алиментарный дефицит, мутации в генах, кодирующих ферменты цикла фолиевой кислоты), а также выбора основного направления фармакотерапии. В результате обследования пациенток не диагностировано клинических и лабораторных маркеров фолатдефицитной анемии, а основной причиной дефицита фолиевой кислоты был выявлен алиментарный фактор.

40 из 43 пациенток I группы (81,6%) с регрессом заболевания был рекомендован «рутинный» цервикальный скрининг в соответствии с отечественными клиническими рекомендациями (ВПЧ-тестирование в сочетании с цитологическим исследованием цервикального образца (co-test) каждые три года). 3 из 43 (18,4%) пациенткам I группы с недостаточностью витамина В9 рекомендовали профилактическую дозу фолиевой кислоты (400 мкг/сут.) с помощью перорального приёма комплексного препарата, содержащего в своем составе комбинацию фолиевой кислоты (200 мкг) и активной формы синтетической фолиевой кислоты 5-МТГФ (L-метилфолат) (200 мкг) по 1 таблетке в сутки в течение трёх месяцев. Выбор данного препарата был определён его возможностями осуществлять дотацию фолатов без учёта генетических полиморфизмов ферментов фолатного цикла. В связи с тем, что абсорбция метафолина может осуществляться без участия различных ферментативных систем кишечной трубки, восполнение необходимого уровня фолиевой кислоты и реализация важнейших обменных функции данного микронутриента (репликация ДНК и метилирование) могут быть осуществлены и у пациенток к дефектом фермента метилентетрогидрофолатредуктазы (МTHFR) [22].

Для пациенток II группы (c персистенцией ВПЧ ВКР) выжидательная тактика была дополнена коррекцией фолатного статуса в зависимости от наличия и выраженности нарушений сывороточного уровня витамина В9. 3 из 30 больных (10,0%) (с дефицитом данного микронутриента) профильными специалистами была назначена фолатная терапия (пероральный прием препаратов фолиевой кислоты 1000 мкг/сут.). 24 из 30 пациенткам (80,0%) данной группы рекомендован профилактический приём комплексного препарата, содержащего в своем составе комбинацию фолиевой кислоты (200 мкг) и активной формы синтетической фолиевой кислоты 5-МТГФ (L-метилфолат) (200 мкг) по 1 таблетке в сутки в течение трёх месяцев. У 3 из 30 женщин данной группы (10,0%) нарушений сывороточного уровня фолиевой кислоты не выявлено.

Пациенткам III группы с прогрессией заболевания в соответствии с актуальными клиническими рекомендациями была выполнена прицельная биопсия шейки матки с последующей морфологической верификацией биоптата. Всем 17 больным с верифицированным CIN II в биоптате выполнена петлевая электрохирургическая эксцизия шейки матки с последующим гистологическим исследованием иссечённого цервикального конуса. По полученным результатам совпадение гистологического заключения (CINII) с результатами прицельной биопсии отмечено у 15 из 17 пациенток (88,2%). У двух из 17 (11,8%) больных отмечено несовпадение диагнозов: в одном случае обнаружена более высокая степень поражения, выявлена carcinoma in situ (CIS), пациентка направлена в специализированное учреждение для дальнейшего наблюдения, в другом — менее выраженное поражение (CINI).

Активная тактика в III группе пациенток сопровождалась медикаментозной коррекцией сывороточных концентраций фолиевой кислоты. 15 из 16 больных (93,7%) с дефицитом витамина В9 получали фолатную терапию (пероральный приём препаратов фолиевой кислоты 1000 мкг в сутки) с контролем её сывороточного уровня в динамике лечения. Одна из 16 пациенток (6,3%) с недостаточностью витамина В9 принимала комплексный препарат, содержащий в своем составе комбинацию фолиевой кислоты (200 мкг) и активной формы синтетической фолиевой кислоты 5-МТГФ (L-метилфолат) (200 мкг) по 1 таблетке в сутки в течение трёх месяцев. Послеоперационное медикаментозное лечение больным III группы заключалось в локальной интравагинальной терапии препаратом, обладающим мультитаргетной противоопухолевой активностью в отношении цервикальных плоскоклеточных интраэпителиальных поражений ассоциированных с ВПЧ, содержащим 3,3’-дииндолилметан по 1 влагалищному суппозиторию (100 мг) два раза в сутки в течение трёх месяцев.

Эффективность дифференцированного подхода к ведению пациенток исследуемых групп оценивали по результатам цитологии цервикальных мазков и иммуноцитохимической реакции коэкспрессии p16ink4α/Ki-67, уровню вирусной нагрузки, результатам кольпоскопического исследования, динамике сывороточного уровня фолиевой кислоты.

Определение сывороточного уровня концентрации фолиевой кислоты проводили методом хемилюминесцентного иммуноанализа на микрочастицах, Architect i2000(Abbott) с использованием набора реагентов ADVIA Centaur FOL производства Siemens Healthcare Diagnostics (Германия). Результаты концентрации витамина В9 интерпретировали в соответствии с референсными значениями — 3,1–20,5нг/мл.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов параметрического и непараметрического анализа с использованием программ IBM SPSS Statistics 28.0.1.1 (разработчик — IBM Corporation), STATISTICA 13.5.0.17 (разработчик — StatSoft.Inc) и пакет MedCalc 20.027.

Во II группе через 6 месяцев статистически значимо снизилась общая доля пациенток с LSIL (со 100,0% до 20,0%; χ2=36,736, p<0,001). По итогам 12 месяцев наблюдения данные изменения цервикального эпителия сохранялись только у двух пациенток (6,7%; χ20-12=48,817, р<0,001). Прогрессия цервикального интраэпителиального поражения до HSIL не выявлена ни у одной больной. Достоверно значимо возросла частота нормальных цервикальных мазков (NILM) (χ2=24,955, p<0,001), снизилась доля пациенток с клинически значимой (>105 геномных эквивалентов ВПЧ ВКР) и малозначимой вирусной нагрузкой (103-5 геномных эквивалентов) (соответственно χ20-12=5,822, p=0,001 и χ20-12=24,955, p<0,001).

Оценка результатов кольпоскопического исследования в динамике ведения не обнаружила статистически значимого прироста баллов, соответствующих средней степени поражения (χ20-12=0,0001, p=1,000). Таковые сохранялись только у двух (6,7%) больных. У 28 (93,3%) женщин спустя 12 месяцев регистрировалась кольпоскопическая норма или минимальная степень повреждения эпителия (0–2 балла) (табл. 3).

Регресс LSIL у пациенток II группы (по данным цитологического, молекулярно-биологического, кольпоскопического исследований) также сопровождался статистически значимой положительной динамикой сывороточных концентраций фолиевой кислоты (табл. 2).

Так, доля женщин с физиологическим уровнем витамина В9 в сыворотке крови возросла с 10,0% до 93,3% (χ20-12=38,443, p<0,001), с «недостаточностью»  — снизилась с 80,0% до 6,7% (χ20-12=29,932, p<0,001). «Недостаточность» сывороточного уровня витамина В9, которая выявлена у 2/30 пациенток данной группы (6,7%) отмечалась на фоне персистенции заболевания: сохранялись цитологические изменения цервикального мазка в пределах LSIL, клинически малозначимый уровень вирусной нагрузки (103-5 геномных эквивалентов ВПЧ ВКР), «средняя» степень поражения цервикального эпителия, по данным кольпоскопического исследования (МКИР), составлял 4 балла, отмечалась положительная реакция коэкспрессии p16ink4α/Ki-67 (у 1 из 30 больных (3,3%). Данной пациентке выполнена прицельная биопсия шейки матки с последующей морфологической верификацией биоптата, которая выявила CINI. Продолжено динамическое наблюдение в рамках клинических рекомендаций.

В III группе пациенток через 3 месяца после активной хирургической тактики статистически значимо возросла доля цитологических результатов NILM (χ2=28,235, p<0,001). У 1/16 женщин (6,25%) цитологические изменения цервикального эпителия соответствовали ASC-US (табл. 4). По итогам 12 месяцев наблюдения отсутствие изменений цервикального эпителия отмечали у всех пациенток 16/16 (100,0%).

В динамике наблюдения от 3 до 12 месяцев статистически достоверно снизилась клинически значимая вирусная нагрузка ВПЧ ВКР (χ20-12=28,235, p<0,001). Иммуноцитохимическое исследование коэкспрессии p16ink4α/Ki-67 не выявило положительной реакции ни у одной пациентки, что имело достоверно значимые различия по сравнению с результатами по данному параметру до хирургического лечения (χ20-12=21,460, p<0,001) (табл. 4).

Результаты кольпоскопического исследования спустя 12 месяцев регистрировали достоверно значимые изменения: минимальная степень повреждения эпителия (0–2 балла) выявлена у всех (100,0%) пациенток данной группы (χ20-12=28,235, p<0,001).

После активной хирургической тактики в отношении HSIL и коррекции фолатного статуса положительная динамика цитологических, иммунобиологических, иммуноцитохимических и кольпоскопических параметров сопровождалась нормализацией сывороточных концентраций витамина В9, которые достигли уровня нормативных значений к концу третьего месяца у 43,8% больных (χ2=6,583, p=0,011), а по итогам 12 месяцев — у 81,3% (χ2=18,656, p<0,001) (табл. 4).

Дальнейшее наблюдение за больными III группы осуществлялось согласно клиническим рекомендациям: проведение цитологического исследования микропрепарата шейки матки и молекулярно-биологического исследования отделяемого из цервикального канала на ВПЧ ВКР для раннего выявления рецидива [21].

Проверка статистических гипотез и апробация разработанного способа прогнозирования прогрессии LSIL была проведена у 43 пациенток I группы (с регрессом заболевания) и у 17 больных III группы (с прогрессией LSIL). Из 43 женщин I группы, у которых по результатам проведённого исследования отмечен регресс заболевания, значения ИРП LSIL < 1 (среднее значение — 0,81±0,02), характеризовало «низкий» риск прогрессии у 38-ми пациенток (88,4%) («истинно-отрицательный» результат). У 5 пациенток данной группы (11,6%) значения ИРП LSIL оказались >1, что соответствовало «высокому» риску прогрессии цервикальной интраэпителиальной неоплазии («ложно-положительный» результат).

В III группе пациенток (с реализацией LSIL в более тяжёлую форму цервикальной дисплазии) средние цифровые значения ИРП LSIL, соответствующие «высокому» риску (>1), составили 1,53±0,29 у 16 из 17 пациенток (88,2%), («истинно-положительные» результаты). У двух из 17 больных III группы (11,8%) с подтверждённым прогрессом LSIL были выявлены «ложно-отрицательные» результаты, поскольку значения ИРП LSIL оказались <1 (0,941 и 0,821).

Возможности разработанного способа прогнозирования прогрессии LSIL демонстрируют ниже представленные клинические наблюдения

У пациентки Д-евой, 1990 г. р., цитологическое исследование цервикального мазка выявило LSIL (Рис.1), ВПЧ-тестирование с генотипированием обнаружило инфицированность ВПЧ 16 типом в клинически значимой концентрации (5,67 lg).

При расширенной кольпоскопии обнаружено наличие аномальных картин I степени (рис. 2).

У пациентки сывороточная концентрация фолиевой кислоты составила 3,0 нг/мл. В анамнезе пациентка перенесла хламидийную инфекцию. Половой дебют в 18 лет. Пациентка замужем, имеет постоянного полового партнера. Данные анамнестические факторы внесены в окно компьютерной программы. Значения ИРП составили 1,074, что соответствовало «высокому» риску прогрессии LSIL (рис. 3).

Пациентка консультирована профильными специалистами, даны рекомендации по коррекции фолатного статуса. Пациентка лечение не провела, через 6 месяцев на приём не явилась. Повторное исследование через 12 месяцев выявило прогрессию заболевания: по результатам цитологического исследования обнаружено поражение высокой степени (HSIL) (рис. 4).

ВПЧ-тестирование с генотипированием выявило дальнейший рост вирусной нагрузки ВПЧ 16 типом в клинически значимой концентрации (6,41 lg). При расширенной кольпоскопии обнаружено наличие аномальных картин II степени (рис. 5). Сывороточный уровень витамина В9 оставался без выраженной положительной динамики (3,7 нг/мл). Иммуноцитохимическое исследование выявило положительную реакцию на коэкспрессию p16ink 4α/Ki-67 в ядрах клеток эпителия с дискариозом (рис. 6).

Результаты гистологического исследования биоптата шейки матки выявили CIN II, края лоскута негативны (рис. 7).

С данной пациенткой проведена активная лечебная тактика (комплексная терапия): конизация шейки матки (подтвердившая CINII) + локальная интравагинальная терапия препаратом, обладающим мультитаргетной противоопухолевой активностью в отношении цервикальных плоскоклеточных интраэпителиальных поражений ассоциированных с ВПЧ, содержащим 3,3’-дииндолилметан по 1 влагалищному суппозиторию (100 мг) два раза в сутки в течение трёх месяцев. Коррекция фолатного статуса. Наблюдение в соответствии с клиническими рекомендациями у пациенток с CINII.

У пациентки Б-евой, 1994 г. р., выявлено LSIL на фоне инфицирования 16 типом ВПЧ в концентрации 4,31 lg (рис. 8).

При расширенной кольпоскопии обнаружены аномальные кольпоскопические изменения I степени (рис. 9). Из анамнеза: половой дебют в 14 лет, ИППП не болела, не замужем, постоянного полового партнера нет.

Сывороточный уровень фолиевой кислоты у данной пациентки составлял 2,6 нг/мл, рекомендовано консультирование профильными специалистами для верификации причины дефицита фолатного статуса и его коррекции.

Выявленные факторы внесены в окно компьютерной программы. Значения ИРП составили 1,533, что соответствовало «высокому» риску прогрессии LSIL (рис. 10)

Спустя 6 месяцев, согласно клиническим рекомендациям, выполнен перечень регламентированных исследований. При повторном консультировании оценена динамика лабораторных и инструментальных методов диагностики шейки матки (цитологическое исследование мазка с эктоцервикса, молекулярно-биологическое исследование отделяемого из цервикального канала на ВПЧ с проведением генотипирования и определением вирусной нагрузки, расширенная кольпоскопия, исследование уровня фолиевой кислоты в сыворотке крови). На фоне повышения концентраций витамина В9 (до 16,1 нг/мл) отмечена нормализация результатов цервикального мазка (рис. 11) и кольпоскопической картины (рис. 12). Результаты генотипирования ВПЧ ВКР показали снижение уровня вирусной нагрузки 16-го типа ВПЧ до клинически малозначимого (102 геномных эквивалентов ВПЧ ВКР).

Проведённое иммуноцитохимическое исследование не выявило положительной реакции коэкспрессии p16ink4α/Ki-67 (рис.13). Рекомендован рутинный цервикальный скрининг в соответствии с актуальными клиническими рекомендациями.

Таким образом, полученные результаты позволили оптимизировать подходы к ведению пациенток с LSIL, ассоциированными с ВПЧ ВКР. Предлагаемый способ с высокой долей достоверности и информативности позволяет прогнозировать прогрессию цервикального плоскоклеточного интраэпителиального поражения низкой степени (LSIL), ассоциированного с ВПЧ и, не нарушая алгоритма актуальных клинических рекомендаций, своевременно формировать среди данных пациенток группу «высокого» риска развития более тяжёлой формы заболевания, индивидуально определять дальнейшую лечебную тактику, обоснованно предпринимать инвазивные лечебно-диагностические вмешательства на шейке матки.