Более полутора лет прошло с момента начала пандемии, вызванной SARS-CoV-2. К июню 2021 г. в мире насчитывалось более 173 млн подтверждённых случаев заболевания новой коронавирусной инфекцией, из которых более 3,7 млн были с летальным исходом1. Широкое развитие методов полногеномного секвенирования и создание общедоступных баз, содержащих данные о нуклеотидных последовательностях вирусов SARS-CoV-2, позволяет изучать особенности циркуляции отдельных клонов возбудителя на различных территориях [1][2][3].

Длина генома SARS-CoV-2 составляет около 30 тысяч пар оснований [4]. В его состав входят 14 открытых рамок считывания (ORF), кодирующих как неструктурные белки (NSP), ответственные за процессы репликации и сборки вирусов, так и структурные белки, включая спайк-белок (S), белок оболочки (Е), мембрану / матрицу (М) и нуклеокапсид (N), а также вспомогательные белки. Первая рамка считывания содержит приблизительно 65% вирусного генома и транслируется либо в полипептид pp1a (nsp 1–11), либо в полипептид pp1ab (nsp 1–16). Другие рамки кодируют структурные и вспомогательные белки. Белок S представляет собой трансмембранный белок, который облегчает связывание вирусной оболочки с рецепторами ангиотензинпревращающего фермента 2 (АПФ2, ACE2), экспрессирующимися на поверхности клеток-хозяев. С точки зрения патогенеза заболевания наиболее значимым компонентом генома коронавирусов является рецептор-связывающий домен (RBD), расположенный в гене спайк-белка вируса и отвечающий за связывание с рецептором клеток человека ACE2, участвуя таким образом в проникновении вируса внутрь клеток. Белок N участвует в репликации РНК, образовании вирионов и уклонении от иммунного ответа. Белок М является одним из наиболее консервативных в структуре белков вириона. Он способствует сборке вирусных частиц. Белок E является самым мелким компонентом в структуре SARS-CoV-2, который облегчает продукцию, созревание и высвобождение вирионов [5][6][7].

В настоящее время ВОЗ выделяет четыре линии SARSCoV-2, которые классифицируются как вызывающие беспокойство (Variants of Concern (VOCs)). В соответствии с номенклатурой PANGO к ним относятся линии B.1.1.7 («британский» геновариант), B.1.351 («Южноафриканский» геновариант), P.1 («бразильский» геновариант) и B.1.617.2 («индийский» геновариант). Им соответствуют обозначения ВОЗ, такие как альфа, бета, гамма и дельта [8]. Линия альфа, впервые идентифицированная в сентябре 2020 г., к апрелю 2021 г. занимала лидирующее положение среди всех определяемых вариантов. Вместе с тем, уже к июню она была вытеснена штаммами SARS-CoV-2, относящимися к линии Pango B.1.617.2, которая имеет индийское происхождение.

Варианты альфа, бета, гамма и дельта характеризуются определенными наборами мутаций в рецепторсвязывающем домене спайк-белка, которые влияют на связывание вирусной оболочки с рецепторами ACE2 [5][6] и могут быть ассоциированы с уклонением от иммунного ответа макроорганизма, что может обеспечивать таким штаммам эволюционное преимущество и способствовать их быстрому распространению. Появление новых линий SARS-CoV-2 с возможно измененными свойствами подчеркивает важность наблюдения за существующими вариантами.

Цель исследования – сравнительный анализ геномного разнообразия вариантов, циркулирующих на территориях Ростовской области и Республики Крым в период с марта по июнь 2021 г.

Задачи:Определить основные линии, выделяемые на территориях Ростовской области и Республики Крым в период с марта по июнь 2021 г.

Определить наличие / отсутствие на данных территориях «британских», «ЮАР», «бразильских» и «индийских» геновариантов.

Провести сравнительный анализ полученных нами данных с данными базы Gisaid по Москве, Московской области и Европе.

Сравнить нуклеотидные последовательности геновариантов, относящихся к линии В.1.1.7 и выявляемых на территории Ростовской области, а также на территории Республики Крым, с образцами, идентифицированными на территории Москвы и Московской области.

Сравнить нуклеотидные последовательности геновариантов, относящихся к линии В.1.617.2 и выявляемых на территории Ростовской области, а также на территории Республики Крым, с образцами, идентифицированными на территории Москвы и Московской области.

Для анализа использовали 203 образца биологического материала, наличие вируса SARS-CoV-2 в которых было подтверждено методом ПЦР. Для подтверждения наличия вируса использовали набор реагентов «АмплиСенс® Cov-Bat-FL». Выделение РНК проводили с использованием набора реагентов «АмплиСенс® РИБО-преп». Получение кДНК проводили с использованием набора «АмплиСенс® Реверта», для наработки специфических ампликонов применяли праймеры, предложенные консорциумом Artic. Cинтез праймеров проводили в ООО «НПФ Синтол» (г. Москва).

Протокол амплификации, предложенный консорциумом Artic, основан на фрагментарной амплификации генома вируса SARS-CoV-2 с использованием 98 пар праймеров, объединённых в два пула. Однако по сообщениям ряда авторов [9][10] одной из проблем при этом является формирование димеров праймеров, снижающих эффективность амплификации. В связи с этим мы пошли по пути увеличения числа пулов, разделив каждый из пулов еще на две равные группы. Визуальная оценка результатов электрофореза показала более выраженные целевые полосы (около 400 п.о.) и меньшую выраженность димеров праймеров (менее 100 п.о.) при использовании четырёх пулов по сравнению с двумя пулами праймеров, что способствовало лучшей наработке целевого продукта амплификации и давало впоследствии более полное покрытие генома. После амплификации с последующим секвенированием нам удалось получить 194 генома вируса, из них 193 – с покрытием более 90%. При этом для 64 образцов получено покрытие 100%.

Полимеразную цепную реакцию проводили в объеме 25 мкл в полистироловых микроцентрифужных пробирках на программируемом многоканальном термоциклере «Терцик» (ДНК-технология, г. Москва).

Инкубационная смесь для ПЦР содержала 20 мМ трис-НСl, рН 8,6; 7 мМ MgCI2, 10 мМ (NH4)2SO4, 0,5 мМ ЭДТА, 100 мкг/мл БСА, по 250 мкМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов, 15 нМ соответствующего праймера, 2 ед. Taq-полимеразы.

Детекцию ампликонов осуществляли в 1% агарозном геле длиной 10 см при напряжении 220 В.

Секвенирование проводили на приборе MiSeq Illumina, использовали набор nextera dna fl ex и картридж на 500 циклов2. Сборка геномов осуществлялась путём выравнивания на референсную последовательность штамма hCoV-19/Wuhan/WIV04/20193 с использованием программ minimap2 [11], samtools [12] и iVar [13].

Генетические линии определяли с помощью программы Pangolin4.

Множественное выравнивание производилось для всего генома и было реализовано с использованием программы mafft [14]. Построение филогенетических деревьев осуществляли с помощью FastTree [15]. Визуализацию проводили с помощью iTOL5. Для проведения сравнительного анализа использовали данные полногеномного секвенирования, полученные из базы данных GISAID [16].

Количественная характеристика результатов определения геновариантов SARS-CoV-2 в исследуемых (с использованием программы Pangolin) образцах с территорий Ростовской области (РО) и Республики Крым (РК) отражена в табл. 1.

Динамичные результаты аналогичного содержания за этот же временной период с использованием данных по Москве и по странам Европы для последующего проведения сравнительного анализа представлены на рис. 1.

По итогам анализа геномов с использованием программы Pangolin установлено, что наибольшее число SARS-CoV-2, выявленных на территориях Ростовской области и Республики Крым за весь период исследований (март – июнь 2021), относятся к линии «B.1.1» (табл. 1).

По нашим данным эта группа геновариантов была наиболее широко представлена в марте (57,7% в Ростовской области и 81,8% в Республике Крым) и апреле (29,6% и 71,4% соответственно) 2021 г. (табл. 2). В последующие месяцы линия В.1.1. выявлялась с меньшей частотой, что являлось следствием увеличения количества изолятов других линий (рис. 1).

Вытеснение В.1.1. происходило, в частности, за счёт стремительного увеличения на территории РФ геноварианта альфа, а также появления изолятов линии В.1.617.2. На графике (рис. 1) видно, что на территориях Ростовской области и Республики Крым изоляты линии альфа появляются в марте (частота обнаружения составляет 8,9% и 2,3% соответственно). При этом уже в мае в Ростовской области среди всех идентифицированных линий линия В.1.1.7 достигает 47,1%, а в Крыму эта величина составляет 26,3% (Таб. 2). В этот же период в Москве и Московской области впервые регистрировались изоляты линии дельта, количество которых с апреля по настоящее время (июнь 2021) продолжает расти. В Ростовской области и Республике Крым «британский» геновариант впервые был обнаружен в марте, и к маю частота выявления представителей этой линии достигла своих максимальных значений на обеих территориях (47,1% и 26,3% соответственно), а в июне их количество стремительно уменьшилось до 6,7% для Ростовской области и 0% для Республики Крым. Изоляты линии В.1.617.2 в Ростовской области и Республике Крым впервые появились в мае, а к июню их количество стремительно выросло (73% в РО и 91% в РК) (табл. 2) и до настоящего времени (июнь 2021 г.) эта линия занимает доминирующее положение (рис. 1).

Увеличение доли линии В.1.1.7 к апрелю 2021 г. с последующим её снижением в мае происходило и на территории Европы. В январе в базе Gisaid (данные базы Gisaid, не вошедшие в табл. 2) среди всех присутствующих на территории Европы геновариантов линия В.1.1.7 занимает 52.8%. К апрелю эта цифра выросла до 90,7%, а в мае снизилась до 76,5%. При этом «индийский» вариант в марте обнаруживался в странах Европы в количестве 0,01%, а уже к июню его доля составила 70,9% (табл. 2).

Для сравнения последовательностей альфа и дельта вариантов, циркулировавших на территориях Москвы и Московской области, а также Республики Крым и Ростовской области в период с мая по июнь 2021 г., были построены дендрограммы отдельно для каждой из генетических линий (рис. 2, 3).

При анализе полученных результатов было выявлено, что вытеснение В.1.1. происходило, в частности, за счёт увеличения на территории РФ геноварианта альфа, а также появления и последующего стремительного роста количества представителей линии В.1.617.2 (рис. 1). На территориях Ростовской области и Республики Крым изоляты линии альфа появляются в марте (частота обнаружения составляет 8,9% и 2,3% соответственно). Всего на указанных выше территориях обнаружено 36 изолятов, относящихся к варианту B.1.1.7 и 20 – относящихся к геноварианту дельта (табл. 1).

При сравнении полученных результатов с данными базы Gisaid, в соответствии с которыми линия В.1.1.7 выявляется на территории Москвы и Московской области в январе с частотой 16,3%, а далее доля обнаружения этих изолятов растёт, достигая к марту 29,0% (данные базы), можно видеть, что тенденция к повышению частоты обнаружения изолятов варианта альфа характерна также для территорий Ростовской области и Республики Крым, но с некоторым отставанием. По-видимому, это связано с тем, что, являясь экономическим и транспортным центром, столица обладает высокой интенсивностью миграционных процессов, как международных, так и внутригосударственных, способствующих распространению SARS-CoV-2 и росту заболеваемости COVID-19 в периферийных регионах страны. По данным базы Gisaid, максимальное количество «британских» геновариантов в Москве и Московской области было обнаружено в марте, а в апреле и далее наблюдалось постепенное уменьшение представителей этой линии (табл. 2).

Таким образом, в странах Европы, на территориях Москвы и МО, Ростовской области и Республики Крым с марта по июнь 2021 г. происходила смена доминирующих геновариантов. В начале весны растет частота обнаружения изолятов, относящихся к линии альфа, а затем геновариант дельта стремительно вытесняет другие линии на всех рассматриваемых в данном исследовании территориях, что, по нашему мнению, связано с его более высокой контагиозностью.

Сравнивая генетические последовательности «британских» изолятов, выявленных на территориях Ростовской области, Республики Крым, а также Москвы и МО, установлено, что подавляющее большинство изолятов линии В.1.1.7, выявленных в Ростовской области за рассматриваемый период, располагались на дендрограмме отдельным кластером. Только один изолят (N 312 Батайск 01.04.2021) не вошел в этот кластер, составив одну ветвь с изолятами Московской области. Полученные результаты свидетельствуют о внутренней циркуляции данного этиологического агента на территории области на фоне отсутствия случаев его заноса с других субъектов РФ и из-за рубежа или наличия единичных случаев завоза с других территорий без дальнейшего распространения среди населения РО (рис. 2).

Максимальное количество SA RS-CoV-2, принадлежащих к линии B.1.1.7 для Ростовской области и Республики Крым приходилось на май, а затем количество этих изолятов стремительно снизилось. Можно предположить, что в весенний период большую часть пассажиропотока составляют люди, перемещающиеся в рамках деловых поездок, поскольку сезон отпусков еще не наступил. В то же время изоляты линии альфа, полученные на территории Крыма, располагаются отдельными небольшими кластерами, что свидетельствует как о наличии в Крыму изолятов, некоторое время циркулирующих на данной территории, так и о множественных завозах на данную территорию из столичного региона.

Изоляты линии В.1.617.2 в Ростовской области и Республике Крым впервые отмечены в мае, а к июню их количество стремительно выросло (73% в РО и 91% в РК). Изоляты, появившиеся в Крыму в мае, расположены на дендрограмме в одном кластере, что может быть обусловлено завозом возбудителя с последующим локальным распространением (рис. 3). В июне происходит стремительное увеличение количества «индийских» геновариантов, что совпадает с начавшимся сезоном отпусков. Июньские изоляты линии дельта, выявленные в Крыму, а также часть майских изолятов этой линии, располагаются на дендрограмме либо отдельно в разных кластерах, образуя при этом общие ветви как с московскими, так и с изолятами, выявленными на территории Ростовской области, либо локально, что свидетельствует о постоянно происходящих заносах. С началом сезона отпусков увеличилась интенсивность распространения вируса среди восприимчивого населения. Вероятно, она будет продолжать нарастать до окончания туристического сезона.

В период с марта по июнь 2021 г. на территориях Ростовской области и Республики Крым происходила постепенная смена доминирующих линий SARS-CoV-2 с преобладанием В.1.1 в марте, увеличением доли изолятов линии альфа в апреле и мае, а затем появление и стремительное увеличение дельта-изолятов к июню на обеих территориях. Единственный изолят линии В.1.315 был обнаружен на территории Ростовской области, а представители линии Р.1 обнаружены не были.

Сравнивая полученные данные с данными базы Gisaid, можно сделать вывод о том, что смена доминирующих геновариантов происходила как на территории Москвы и МО, так и на территории Европы, но в более ранние сроки. По видимому, основными воротами для ввоза новых линий на территорию России является столица, как основной логистический центр страны. А распространение изолятов вглубь территории, в основном, осуществляется с некоторой задержкой, что позволяет прогнозировать ситуацию в регионах.

«Британские» варианты, выявленные в Ростовской области, по видимому какое-то время циркулировали на этой территории и накопили пул общих мутаций, в то время как изоляты данной линии, выявленные в Крыму, демонстрировали сходство генома с различными изолятами, выявленными на территории Москвы и МО, что указывает на серию независимых завозов данных вирусов на территорию республики.

Большинство изолятов «индийского» варианта, идентифицированные в конце мая и начале июня в Крыму, отличаются от московских и, вероятно, какое-то время циркулировали на территории Крыма, в то время как В.1.617.2, изолированные в июне, а также изоляты, выявленные в Ростовской области, проявляют больше сходства с московскими.

Наблюдаемое в летний период распространение линии В.1.617.2 уже привело к росту заболеваемости. При условии несоблюдения населением мер личной и общественной безопасности, а также при несвоевременной вакцинации, вероятно, количество больных ещё может увеличиваться, достигнув пика в сентябре-октябре, когда завершится сезон отпусков и основная масса населения вернется в организованные коллективы по месту учебы и работы.

1. https://www.who.int/publications/m/item/weekly-epidemiologicalupdate-on-covid-19---1-june-2021 2. https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nexteradna-flex-kit/documentation.html 3. GenBank Accession Number MN908947.3 4. https://github.com/cov-lineages/pangolin 5. https://itol.embl.de