Тенденцией последних десятилетий стало отодвигание деторождения на более поздний период времени [1], что порождает ряд проблем, связанных с прогрессирующим возрастным нарушением фертильности. Одной из причин данного явления может служить естественное уменьшение фолликулярного резерва, сопровождающегося снижением продукции антимюллерова гормона (АМГ), ингибина В, повышением концентрации ФСГ в фолликулиновую фазу [2][3]. Тем не менее, прогностическое значение указанных гормонов в отношении бесплодия не всегда подтверждается. Изучена связь маркеров овариального резерва (АМГ, ФСГ, ингибин В) с фертильностью пациенток в возрасте 30–44 лет, при этом не было выявлено связи между уменьшением резерва яичников и снижением фертильности [4]. В другом исследовании подтверждается прямая корреляционная связь между количеством антральных фолликулов, полученных стимулированием в длинном протоколе, с частотой клинической беременности: у женщин с 1–8 антральных фолликулов беременность наступала в 28,25% случаев, а при количестве антральных фолликулов >18 беременность диагностировали у 40,13% женщин [5].

Также одной из причин нарушения фертильности в старшем репродуктивном возрасте является отягощенный гинекологический анамнез. Инфекционные процессы и хронический эндометрит, несомненно, служат факторами риска бесплодия. Так, у 45% бесплодных пациенток в анамнезе был хронический эндометрит. К другим факторам риска относят повышенный индекс массы тела, стресс, курение обоих супругов [6]. У пациенток с эндометриозом вероятность зачатия даже с использованием ЭКО значительно снижается [7]. Наблюдающаяся при эндометриозе дисрегуляция гипоталамо-гипофизарно-яичниковой оси и воспалительная реакция, индуцированная эктопическими очагами эндометрия, формирует неблагоприятную микросреду фолликулов, что в конечном итоге снижает компетентность ооцитов и восприимчивость эндометрия [8]. Гиперпластические процессы эндометрия, внутриматочные спайки, подслизистые и интрамуральные миоматозные узлы и аденомиоз значительно осложняют имплантацию зародыша [9]. Онкологическая патология и связанная с ней терапия могут стать причиной снижения фертильности [10].

В значительном ряде случаев при сознательном откладывании беременности преодолеть возрастное снижение фертильности помогают вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) и криоконсервация ооцитов.  Однако даже в этом случае вероятность успеха значительно снижена по сравнению с пациентками в более молодых возрастных группах [11]. Перечисленные выше факты подчеркивают актуальность всестороннего изучения причин бесплодия у пациенток старшего репродуктивного возраста с целью повышения эффективности программ ВРТ у данного контингента.

Цель исследования — сравнительное изучение структуры бесплодия и исходов программ ВРТ среди пациенток разных возрастных групп.

Исследование проводилось на базе акушерско-гинекологической клиники репродукции «Эмбрио» (Сочи). Все участницы исследования (n=180) дали информированное согласие на исследование и публикацию его результатов.

Критерии включения в исследование  — возраст 25–48 лет, продолжительность бесплодия не менее 3 лет, фертильная или субфертильная сперма супруга, нормальный кариотип у обоих супругов, сохранный менструальный цикл, отсутствие тяжелой соматической и онкологической патологии.

Изучены данные клинических и лабораторных и инструментальных методов, исследования в том числе содержание половых гормонов, уровень антимюллерова гормона (АМГ), маркеры инфекционных агентов, УЗИ малого таза, иммуногистохимическое исследование аспирата полости матки (пайпель-биопсия) с определением прогестероновых (PR) и эстрогеновых (ER) рецепторов, плазматических клеток, NK-клеток, LIF, оценка оогенеза и эмбриогенеза и анализ исходов процедур ВРТ.

Когорта пациенток были разделена на две равные возрастные группы. I группа — ≥35лет (38,78±3,31 лет), 90 человек, II группа — моложе 35 лет (29,5±2,60 лет), 90 человек. В дальнейшем в зависимости от примененного протокола ВРТ произведено разделение на подгруппы. Короткую схему (с использованием антагонистов гонадотропин-релизинггормона, ант-ГнРГ) получали 45 пациенток в I группе (IA) и 48 — во II (IIA). Длинную схему (назначали агонисты гонадотропин-релизинг гормона аГнРГ) получали 45 пациенток в I группе (IБ) и 42 — во II (IIБ).

Статистический анализ данных выполняли в программе SPSS. Разницу в значениях категориальных переменных оценивали посредством таблиц сопряженности с использованием критерия Хи-квадрат Пирсона. При оценке непрерывных переменных в случае нормального распределения применяли Т-критерий Стъюдента, для непараметрических данных — U-критерий Манна-Уитни. Пороговым значением значимости считали p=0,05.

Продолжительность бесплодия для всей когорты составила 6,77±3,92 года. В I группе — 9,02±4,51 года, во II — 4,51±1,74 года (p<0,05), что представляется закономерным следствием возрастных различий между группами. Внутри каждой группы продолжительность бесплодия по подгруппам (в зависимости от протокола стимуляции) достоверно не различалась.

Возраст менархе статистически не различался между группами и составил 13,58±1,6 лет в I группе и 13,43±1,64 лет — во II. Длительность менструального цикла— в среднем 28,36±3,16 дней. Между группами наблюдались существенные различия в его продолжительности. Более короткая продолжительность менструального цикла наблюдалась среди пациенток в I группе (p=0,001), что может быть связано как с накопившейся с возрастом патологией, так и с падением продукции прогестерона желтым телом во второй фазе менструального цикла. Внутри каждой группы достоверных различий не наблюдалось, что подтверждает групповую однородность.

Между двумя возрастными группами выявлены достоверные различия (p<0,05) по частоте обнаружения первичного и вторичного бесплодия: в I группе вторичное бесплодие было диагностировано у 51 пациенток из 90, а во II — у 11 из 90. Вероятным объяснением такого распределение служит то, что частота патологии, приводящая к бесплодию, повышается с возрастом и пациентки в I группе могли быть ранее фертильными. Трубно-перитонеальный фактор бесплодия у пациенток I группы обнаруживался чаще, чем во II (p=0,063).

Такое распределение, вероятно, объясняется возрастным аккумулированием воспалительной патологии, которая может нарушать проходимость маточных труб. Для уточнения этого аспекта сравнили частоту генитальной патологии в обеих группах.

В I группе достоверно чаще наблюдалась реализация наследственных нарушений свертывания, препятствующих зачатию и беременности (36,6% vs 11,1%, p=0,001). Анализ частоты экстрагенитальной патологии не обнаружил статистически достоверной разницы между группами (р>0,05).

Итоговое число оперативных вмешательств у пациенток I группы было статистически значимо выше (p=0,009). Наиболее часто выполнялась односторонняя тубэктомия (p=0,019), что, вероятно, свидетельствует о наличии исходного провоспалительного фона.

Средние показатели гормонального профиля всех пациенток находились в пределах нормальных референсных интервалов. Однако наблюдалось статистически значимое возрастание уровня ФСГ у пациенток I группы, составившее 9,73±2,43 пг/мл против 8,74±2,50 пг/мл во II группе (p=0,008). Повышение уровня ФСГ может быть маркером тенденции к уменьшению фолликулярного резерва, что наблюдается у пациенток старших возрастных групп. Пониженные значения ЛГ в I группе 7,05±2,4 пг/мл против 8,01±2,1 у пациенток IIгруппы, (p=0,011) могут свидетельствовать о недостаточной стимуляции яичников со стороны гипофиза. Недостаток ЛГ или несвоевременный пик его концентрации может быть причиной неудач ВРТ. Выбранная схема прегравидарной подготовки достоверно не влияла на содержание ЛГ и ФСГ. Повышенные уровни пролактина могут замедлять созревание яйцеклеток и приводить к ановуляции, однако в когорте этот показатель в основном был в пределах нормальных значений (86-650 МЕ/л). Концентрация пролактина между группами и в зависимости от схем прегравидарной подготовки практически не отличалась и составила 193,57±60,46 пг/мл в Iгруппе и 208,22±96,88 пг/мл во IIгруппе, р>0,05. Уровень эстрадиола в периферической крови между возрастными группами и внутри групп статистически значимо не различался, составив 299,222±145,79 пг/мл в I группе и 287,64±142,75пг/мл — во II (р>0,05). Концентрация прогестерона в I группе составила (29,03±17,95 пг/мл) и была достоверно ниже (p<0,05), чем во IIгруппе (34,77±17,24), что на фоне сохраняющегося уровня эстрадиола свидетельствует об относительной гиперэстрогенемии у пациенток старшего репродуктивного возраста.

Антимюллеров гормон (АМГ) наряду с фолликулярным резервом и возрастом пациенток служит предиктором наступления беременности. В целом для когорты средний уровень АМГ равнялся 3,13±1,93 нг/мл, были выявлены достоверные различия между двумя группами. Пониженное значение АМГ у пациенток I группы (2,78±1,92 пг/мл) по сравнению с 3,48±1,89 пг/мл (II группа) может указывать на нарушение процесса созревания фолликулов, что в свою очередь снижает вероятность наступления беременности.

Измеренная при УЗ-исследовании толщина эндометрия в когорте в среднем равнялась 7,78±2,45 мм: 7,50±2,21 мм для I группы, 8,06±2,66 мм (p=0,125) — для II. Снижение толщины эндометрия в старшей возрастной группе подтверждает предположение о недостаточности пролиферативной фазы, что дополняется показанным выше снижением уровнем прогестерона в старшей группе. Снижение овариального резерва (определяемого по числу зрелых фолликулов на УЗИ) наблюдалось у 30 (33%) пациенток ≥35 лет и только у 3 (3,3%) пациенток до 35 лет (p<0,05), поскольку с возрастом пул фолликулярных клеток уменьшается.

При проведении пайпель-биопсии на 19–21 дни менструального цикла в I группе выявлены статистически значимо пониженные концентрации ER и повышенные концентрации PR в железистом эпителии и в стромальных клетках эндометрия по сравнению с аналогичными показателями во II группе. В крови пациенток I группы определяли немного более высокие уровни эстрогена и достоверно сниженные значения прогестерона по сравнению с концентрацией этих гормонов у пациенток второй группы.  Повышенная концентрация рецепторов к прогестерону может быть компенсаторной реакцией на снижение его концентрации у пациенток ≥35 лет (табл. 1).

В представленной ниже таблице показано содержание остальных маркеров эндометрия (табл. 2).

Достоверных различий по большинству указанных показателей не наблюдалось. Уровень значимости, приближающийся к пороговому (p=0,073), определялся для уровня CD56 (NK-клетки), повышенное число которых свидетельствует о напряжении клеточного иммунитета преимущественно у пациенток во II группе. Повышение уровня NK-клеток сопряжено с бесплодием [12]. У пациенток I группы был статистически значимо снижен LIF как в железистом эпителии, так и в клетках стромы, что свидетельствует о сниженной способности эндометрия к имплантации.

В результате проведения 180 циклов стимуляции овуляции было получено 1721 ооцитов: 751 в I группе, 970 – во II. В I группе количество полученных ооцитов было достоверно меньше, составив 8,34±3,51 против 10,78±4,37 ооцита на одну индукцию во II группе (p<0,001), медианные значения составили 8 и 10 ооцитов на 1 пациентку соответственно (рис. 1).

Вероятным объяснением меньшего числа ооцитов в старшей возрастной группе является снижение овариального резерва, что согласуется с пониженным числом антральных фолликулов, о чем было сказано ранее.

Из 1721 ооцита, полученных в ходе индукции овуляции зрелыми и качественными, были признаны 1386 ооцита (80,5% от всех полученных), остальные были незрелыми (12,5%) или дегенеративными (7%) (рис. 2). Количество зрелых ооцитов в I группе составило 533, 853 — во II.

Снижение числа зрелых ооцитов в I группе может быть следствием недостаточной стимуляции со стороны гипофиза и возрастного угасания функции яичников. Для процедур ВРТ использовали зрелые ооциты хорошего качества.

1386 ооцитов было оплодотворено, из них было получено только 977 (70,5%) эмбрионов хорошего и удовлетворительного качества.

У пациенток 35 лет и старше число ооцитов, подходящих для оплодотворения, было ниже (4,11±1,43 против 6,74±2,92), чем во II группе (p<0,001). Медианные значения также существенно различались (рис. 3).

Различия в протоколах прегравидарной подготовки не проводили к достоверным различиям в числе полученных эмбрионов (табл. 3).

Таким образом, до момента оплодотворения яйцеклеток не удалось выявить существенных различий, обусловленных протоколом стимуляции. Основные различия наблюдались только между разными возрастными группами.

На 3-и и 5-е сутки после оплодотворения проводилась ревизия качества эмбрионов (выполнялась эмбриологом). Окончательную оценку по Гарднеру проводили на 5-й день (табл. 4). Некачественные эмбрионы утилизировались.

Статистический анализ данных выявил существенное снижение качества эмбрионов (p=0,018) у пациенток I группы в старшем репродуктивном возрасте. Во II группе отмечалось более высокое качество эмбрионов.

На 5-е сутки в I группе осталось 306 эмбрионов, пригодных к эмбриопереносу, во II группе — 534 (p<0,001), что примерно соответствует распределению полученных ооцитов. По отношению к количеству качественных эмбрионов, полученных сразу после оплодотворения, содержание качественных эмбрионов к 5-му дню культивирования составило 85,98% (82,70% в I, 87,97% — во II  (рис. 4). Свой вклад в утрату качественных эмбрионов могли внести анеуплоидии, частота которых увеличивается с возрастом пациентки.

Выбор протокола стимуляции не отразился на качестве эмбрионов (p=0,940). Таким образом качество полученных эмбрионов зависело в основном от возраста, а не от протокола стимуляции.

Из всей когорты у 53 (29,40%) пациенток по результатам УЗИ и лабораторных тестов была диагностирована беременность. В I группе беременность наступила в 20 (22,22%) случаях, во II — в 33 (36,67%) случаев (p=0,034). При этом не наблюдалось значительных расхождений в зависимости от протокола стимуляции (табл. 5).

Полученные результаты совпадают с описанным в литературе снижением фертильности у пациенток с возрастом, особенно в диапазоне 31–38 лет [13][14]. Также были проанализированы потенциальные предикторы наступления беременностидля всей когорты пациенток (табл. 6).

Как видно из данных, представленных в таблице, повышенная частота наступления беременности совпадает с более высокими уровнями прогестерона, большей толщиной эндометрия, повышенным числом ооцитов и эмбрионов к 5-му дню культивирования. Указанные параметры говорят о лучшей готовности эндометрия к имплантации и о повышенном качестве эмбрионов у пациенток с наступившей беременностью (табл. 6, 7).

Хотя ФСГ (до протокола стимуляции) был повышен у пациенток с наступившей беременностью, это различие не было достоверным между беременными и небеременными, но имелись выявленные ранее повышенные уровни ФСГ в крови пациенток I группы. Различия в уровне прогестерона между беременными и небеременными были сильнее выражены во II группе (p<0,001 и p=0,067 соответственно) (табл. 8).

Уровень АМГ у пациенток ≥35 лет с установленной беременностью оказался ниже, чем у небеременных. Это может быть связано с особенностью обследованной популяции, а также с тем, что анализ на АМГ выполнялся в циклах, предшествующих ВРТ. Во II группе достоверных различий по уровню АМГ не наблюдалось.

В обеих группах толщина эндометрия была достоверно выше у пациенток с наступившей беременностью, что отражает лучшую готовность слизистой матки к имплантации эмбриона. Во II группе число полученных ооцитов (p=0,004) и качественных эмбрионов к 5-му дню (p=0,055) лучше коррелировало с наступлением беременности, чем в I группе.

Во II группе число ооцитов и качественных эмбрионов к 5-му дню дробления было выше в случае наступления беременности. Возможно, структура бесплодия различается по возрастам, и в возрасте 35 лет и старше основными причинами нарушения служат состояния эндометрия и качество эмбрионов (повышается вероятность анеуплоидий), в более молодых возрастных группах исход ВРТ больше зависит от эффективности гаметогенеза и качества самого эмбриона. Не исключено, что в старшей возрастной группе частота бесплодия сильнее связана с рецептивностью эндометрия, нежели с качеством эмбрионов.

Из 180 обследованных пациенток у 38 (21,11%) были зарегистрированы живорождения (13 (14,44%) в I группе, у 25 (27,78%) (p=0,028) — во II). Таким образом, наблюдалось почти двукратное превышение числа живорождений во II группе. Внутри обеих групп не было достоверных различий в зависимости от протокола стимуляции (I — p=0,76; II — p=0,208).

Далее были рассмотрены возможные предикторы частоты живорождений (табл. 9).

Полученные результаты в целом повторяют тенденции, обнаруженные при диагностированной беременности. У родивших пациенток определялись повышенные уровни прогестерона, ЛГ, диагностирован более толстый эндометрий, большее число ооцитов и эмбрионов к 5-му дню культивирования (табл. 10).

Как и при анализе наступления беременности, частота живорождений, очевидно, совпадает с повышенными уровнями ЛГ, прогестерона, большей толщиной эндометрия, большим числом полученных ооцитов и эмбрионов к 5-му дню культивирования. Для значений пролактина, ФСГ и эстрадиола не было выявлено достоверных корреляций с исходом ВРТ.

Проведенное исследование когорты из 180 пациенток с бесплодием в анамнезе позволило выявить ряд факторов, совпадающих с нарушением фертильности у пациенток ≥35 лет. По сравнению со II группой у них определялась большая продолжительность бесплодия (9,02±4,51 vs 4,51±1,74 лет) и повышенная частота вторичного бесплодия (28,3% vs 6,1%). У пациенток старше 34 лет чаще обнаруживались воспалительные и онкологические заболевания (полипы, миомы, сальпингоофориты, эндометриты), что сопровождалось высокой частотой диагностики спаечных процессов, обнаружения трубно-перитонеального фактора бесплодия и односторонних тубэктомий в анамнезе (p<0,05). В I группе продолжительность менструального цикла составляла 27,15±3,39 дней, во II — 29,57±2,38 (p=0,001), и это, вероятно, отражает возрастное снижение продукции прогестерона желтым телом.

Уровень ЛГ в I (старшей) группе был достоверно снижен, а концентрация ФСГ, напротив, повышена по сравнению с аналогичными параметрами во II группе. Низкая выработка ЛГ может приводить к недостаточной стимуляции яичников со стороны гипофиза, а повышенное содержание ФСГ скорее отражает снижение овариального резерва, прогрессирующего с возрастом. Вероятным маркером угнетения функции яичников служит низкий уровень прогестерона у пациенток ≥35 лет (29,03±17,95 vs 34,77±17,24) и пониженная концентрация АМГ (2,78±1,92 vs 3,48±1,89) по сравнению со значениями этих показателей во II группе. Толщина эндометрия в I группе была недостоверно снижена, составив 7,50±2,21 мм, а для II группы —  8,06±2,66 мм (p=0,125). Снижение овариального резерва (по данным УЗИ) определялось у 33% пациенток в I группе и только у 3,3% во II. В аспирате слизистой оболочки матки обнаружилось достоверное повышение концентрации рецепторов к прогестерону и снижение концентрации эстрогеновых рецепторов, а также снижения уровня LIF у пациенток I группы. Таким образом, лабораторные и инструментальные данные свидетельствуют о накопленной генитальной патологии, снижении овариального резерва и недостаточной готовности эндометрия к имплантации у пациенток старшей возрастной группы. 

С данными о снижении овариального резерва и нарушением гормональной регуляции в I группе согласуется достоверно меньшее число ооцитов и эмбрионов хорошего качества (p<0,05), которые удалось получить на разных стадиях культивирования. Причем доля эмбрионов хорошего качества к 5-му дню интенсивнее снижалась в I группе, что может говорить о скрытых дефектах, наличие которых невозможно установить по одним только морфологическим признакам.

В I группе беременность наступила у 22,22% пациенток, число живорождений составило 14,44%, во II группе —36,67% и 27,78% соответственно. Причем протокол стимуляции не влиял на исходы ВРТ. Это подтверждает описанное в литературе прогрессирующее снижение фертильности у пациенток в диапазоне 31–38 лет [9][10]. Наиболее надежными предикторами благоприятного исхода ВРТ оказались повышенный уровень прогестерона, большая толщина эндометрия, большое число ооцитов, полученных при трансвагинальной пункции и количество качественных эмбрионов к 5-му дню культивирования. Повышенная толщина функционального слоя эндометрия, по-видимому, связана с большой концентрацией прогестерона во вторую фазу менструального цикла и соответствует лучшей рецептивности эндометрия. Конечный успех процедур ВРТ определяется большой совокупностью факторов, но с возрастом увеличивается роль эндокринной, воспалительной, онкологической патологий, способных влиять на женскую фертильность, а также наблюдаются дефекты эмбрионального фактора и имплантационного фактора эндометрия.

Проведенное исследование структуры бесплодия у пациенток ≥35 лет и моложе 35 лет позволило сделать следующие выводы: