Перевезенцев Олег Александрович, кандидат медицинских наук, ассистент кафедры персонализированной и трансляционной медицины
Ростов-на-Дону
Холодная Татьяна Олеговна, кандидат медицинских наук, ассистент кафедры персонализированной и трансляционной медицины
Ростов-на-Дону
Новикова Екатерина Александровна, ассистент кафедры персонализированной и трансляционной медицины
Ростов-на-Дону
Самсонов Андрей Евгеньевич, доцент кафедры персонализированной и трансляционной медицины
Ростов-на-Дону
Бурцев Дмитрий Владимирович, доктор медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой персонализированной и трансляционной медицины
Ростов-на-Дону
Цель: провести молекулярно-генетическую диагностику SARS-CoV-2 у бессимптомных индивидуумов Ростовской области.
Материал и методы: было обследовано 22037 индивидуумов, которые на момент сдачи материала не имели клинически выраженных симптомов респираторного заболевания COVID-19. Молекулрно-генетическая диагностика SARS-CoV-2 проводилась методами RT-PCR и изотерической амплификации с ручным и автоматическим выделением вирусной РНК.
Результаты: положительный результат был выявлен у 297 индивидуумов, подтверждён результат региональным референсным центром у 149 человек (0.68 %). Среди общей выборки было обследовано 3090 «контактных» пациентов (положительный результат — в 78 случаях (2.52 %)), 8109 медицинских работников (положительный результат – в 23 случаях (0.28 %)) и 3098 «контактных» медработников (положительный результат — в 24 случаях (0.77 %)).
Выводы: применение молекулярно-генетического тестирования SARS-CoV-2 для выявления асимптомных случаев имеет серьёзные ограничения, поэтому для данной диагностической задачи необходима разработка альтернативных методов лабораторной диагностики, основанной на особенностях этиопатогенеза новой коронавирусной инфекции.
Objective: conduct molecular genetics diagnosis of SARS-CoV-2 in asymptomatic individuals in the Rostov region.
Material and methods: 22037 individuals who at the time of delivery of the material did not have clinically expressed symptoms of respiratory disease COVID-19 were examined. Molecular genetics diagnosis of SARS-CoV-2 was carried out by RT-PCR and LAMP with manual and automatic isolation of viral RNA.
Results: a positive result would be detected in 297 individuals, the result would be confirmed by the regional reference center in 149 people (0.68 %). Among the total sample, 3090 “contact” patients were examined (78 people, or 2.52 %) found positive results, 8109 medical workers (23 cases positive, or 0.28 %) and 3098 “contact” health workers (24 cases positive, or 0.77 %).
Conclusions: based on the results obtained, it can be concluded that the use of molecular genetic testing of SARS-CoV-2 for the detection of asymptomatic cases has serious limitations, therefore, for this diagnostic task, it is necessary to develop alternative laboratory diagnostic methods based on the features of the etiopathogenesis of a new coronavirus infection.
Коронавирусы (СoV) (Coronoviridae) — это семейство вирусов, содержащих в качестве генетического материала одноцепочечную (+) РНК, со специфическими гликопротеидными шипами (спайками) вокруг вирусного капсида, которые при электронном микрокопировании похожи на солнечную корону [
Изучение факторов патогенности коронавируса SARSCoV-2 показало, что в клетки человека он проникает через рецепторы к ангиотензин-превращающему ферменту 2-го типа (ACE2), который достаточно широко представлен в различных тканях: он экспрессируется в легких на уровне альвеол, кишечнике, гонадах, почках и т.д. [
В настоящее время специфическими методами диагностики новой коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 являются молекулярно-генетические методы, в частности, в качестве референсного используется метод ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией вирусной РНК [
Из-за достаточно стремительного распространения нового коронавируса по миру особое значение приобретает максимально широкий охват данным молекулярно-генетическим тестированием населения различных стран для эффективного проведения противоэпидемических мероприятий и быстрое проведение тестирования [
Цель исследования — провести оценку выявляемости короновирусной инфекции SARS-CoV-2 у бессимптомных индивидуумов Ростовской области молекулярно-генетическими методами ПЦР в реальном времени и изотермической амплификации.
В ПЦР-отделе лаборатории клинической патоморфологии и молекулярно-биологических исследований ГАУ РО Областной консультативно-диагностический центр было протестировано на SARS-CoV-2 22037 индивидуумов, которые на момент сдачи материала не имели клинически выраженных симптомов респираторного заболевания COVID-19. Среди общей выборки было обследовано 3090 человек, контактировавших с больными COVID-19 (группа «контактных»), 8109 медицинских работников и 3098 «контактных» медработников. В качестве биоматериала использовались назальный и фарингеальный соскобы, зонды с которыми помещались в пробирку типа Eppendorf с транспортной средой для увеличения вирусной нагрузки. Молекулярно-генетическое качественное исследование проводилось методом ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией в одной пробирке с использованием тест-систем «РеалБест РНК SARS-CoV-2» (ООО «Вектор бест», Новосибирск) (заявленная чувствительность — 1000 копий/мл) с использованием автоматического выделения вирусной ДНК на платформе KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific) набором «РеалБест УниМаг», тест-системы для выявления РНК коронавирусов SARS-CoV-2 и подобных SARS-CoV (ООО «ДНК-технология», Москва) c ручным выделением вирусной РНК (заявленная аналитическая чувствительность — 500 копий/мл, используются праймеры к специфической последовательности генов E и N РНК SARSCoV-2), а также методом изотермической амплификации с использованием тест-системы Изотерм SARS-CoV-2 РНК Скрин (ООО «Дженериум», резидент Сколково, Владимирская обл.) (заявленная аналитическая чувствительность — 1000 копий/мл). Критерии положительного результата анализа для каждой из тест-систем представлены в табл. 1. При анализе использовался один положительный и один отрицательный контрольный образец. 95 % образцов было проанализировано двумя указанными выше тест-системами, основанными на RT-PCR. Положительные образцы отправлялись для подтверждения результата в референсную лабораторию регионального ФГБУЗ. Полученные результаты анализировались в программе Statictica 6.0.
Таблица / Table 1
Критерии положительного результата молекулярно-генетических тест-систем, использованных для специфической лабораторной диагностики инфекции SARS-CoV-2Criteria for positive results of molecular genetic test systems, used for specific laboratory diagnostics of infection SARS-CoV-2
В табл. 2 представлены обобщенные результаты молекулярно-генетического тестирования бессимптомных индивидуумов на новую коронавирусную инфекцию с выделением ряда подгрупп тестируемых.
В табл. 3 представлен сравнительный анализ положительных и подтверждённых референсным ФБУЗ результатов молекулярно-генетического анализа на COVID-19, выполненных на платформе двух различных тест-систем, основанных на методе ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией вирусной РНК.
Таблица / Table 2
Сводная таблица результатов молекулярно-генетического тестирования бессимптомных пациентов на инфекцию SARS-CoV-2Summary table of molecular genetic testing asymptomatic patientsfor SARS-C0V-2 infection
Группа пациентов (% от общего числа) Общее кол-во Кол-во положительных результатов Кол-во потверж- дённых референсным ФГБУЗ Доля положити- тельного результатов (%) Доля ложноположительного результатов (%) Всего (100 %) 22037 297 149 0,68 49,8 «Контактные» (14 %) 3090 172 78 2,52 54,7 Медицинские работники (36,8 %) 8109 38 23 0,28 39,4 «Контактные» медицинские работники (14 %) 3098 38 24 0,77 36,8
Таблица / Table 3
Сравнение положительных и подтвержденных рефересным ФБУЗ результатов молекулярно-генетического тестирования на SARS-C.V-2, выполненных на платформе двух тест-систем методом RT-PCR Comparison ofpositive and verified by reference centre molecular genetics results of SARS-CoV-2, made on the platform of two test systems by RT-PCR method
Тест-система Количество положительных результатов Количество подтверждённых ФБУЗ результатов % подтверждённых результатов от общего кол-ва тестов % ложноположительных результатов SARS-CoV-2 / SARS-CoV («ДНК-технология») (ручное выделение) 126 68 (до 18.05) 0,31 46,0 «РеалБест РНК SARS-CoV-2» (автоматическое выделение) 171 81 (до 18.05) 0,37 52,6
Согласно результатам данного исследования, в общей когорте бессимптомных индивидуумов количество выявленных случаев инфекции SARS-CoV-2 составляет всего 0.68 %. Среди общей популяции на порядок выше величина инфицирования среди лиц, которые находились в контакте с заболевшими COVID-19 (2,52 %). Среди медицинских работников уровень инфицируемости составляет 0,28 %, что ниже средних значений, но среди медиков, которые контактируют с больными и инфицированными новой коронавирусной инфекцией, уровень выявленных случаев SARSCoV-2 несколько выше (0,77 %), чем среднее значение.
Таким образом, в выборке лиц, не имеющих симптомов новой коронавирусной инфекции, в том числе и из групп риска, наблюдается достаточно низкое значение положительных результатов молекулярно-генетической диагностики на SARS-CoV-2. Причин этому может быть несколько. Первой из них является действительное отсутствие инфицирования у таких лиц. Видно, что в группе «контактных» индивидуумов выявляемость вируса на порядок выше,чем общей группе, что подтверждает нахождение такихлюдей в группе риска. Но даже в этой подгруппе процент положительных результатов не такой высокий, как можнобыло прогнозировать. Известно, что лабораторного коронавирусной инфекции должны применяться только длярешения определённых диагностических задач [
Что касательно высокого процента ложно-положительны результатов, которые показаны в настоящем исследовании, то одним из объяснений этого может быть ложное срабатыванием молекулярно-генетических тест-систем на другие виды сезонных коронавирусов, которые уже давно циркулируют в человеческой популяции. В настоящее время четкие причины высокого процента результатов такого рода выявить сложно, учитывая то, что в коммерческих тест-системах дизайн использованных праймеров в открытой печати не публикуется.
Несмотря на активное развитие в настоящее время методов специфической лабораторной диагностики новой коронавирусной инфекции остаётся немало сложностей для выявления бессимтомных носителей SARS-CoV-2. До конца не изучена стадийность репликации и вирусовыделения SARS-CoV-2 при бессимптомном носительстве, что также усложняет точное выявление новой коронавирусной инфекции. Поэтому на данный момент необходима разработка тестов для выявления бессимптомных SARS-CoV, которые базировались бы не только свойствах этиологического агента, но и на особенностях патогенеза данной инфекции, что должно повысить их чувствительность, специфичность и диагностическую значимость. Примером таких тестов может служить созданная американским учеными лабораторная диагностическая тест-система, основанная на технологии генетического редактирования CRISPR-Cas 12 [
Финансирование. За счёт ГАУ РО Областной консультативно-диагностический центр.Financing. At the cost Regional consulting and diagnostic center, Rostov-on-Don.Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствииконфликта интересов.Conflict of interest. Authors declares no conflict of interest.
1. Center for Systems Science and Engineering (2020) CoronavirusCOVID-19 global cases. Johns Hopkins University. Accessed 3 Apr 2020. https://coronavirus.jhu.edu/map.html 2. Centers for Disease Control and Pevention. Interim Guidelines for Collecting, Handling, and Testing Clinical Specimens from Persons for Coronavirus Disease 2019 (COVID-19). https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-nCoV/lab/guidelines-clinical-specimens%20html 3. FIND. COVID-19 Diagnostics Resource Centre. http://www.finddx.org/covid-19/
The authors declare that there are no conflicts of interest present.