Холерные вибрионы способны образовывать биопленки как на биотических, так и на аби­отических поверхностях. Формирование био­пленки можно рассматривать как один из факторов персистенции этих микроорганизмов, так как биопленочные штаммы демонстрируют множественную лекарственную устойчивость [1], устойчивость к дезинфектантам [2], что представляет собой потенциальную угрозу для здо­ровья человека. Формируя биопленки, микроорганиз­мы могут быть в 1000 раз более устойчивыми к стрессу, чем планктонные формы [3,4], сохраняя при этом спо­собность к заражению. Биопленки являются защитным механизмом, позволяющим холерным вибрионам вы­живать на поверхностях гидробионтов, в то время как их планктонные варианты погибают [5,6]. Также рядом авторов была выдвинута гипотеза о том, что штаммы V. cholerae, ассоциированные с хитином, лучше защищены во время транзита через кислотный барьер желудка, что позволяет большему количеству бактерий достичь места колонизации тонкой кишки [7,8].

В последнее время в связи с увеличением использо­вания пластика в промышленности и быту происходит загрязнение вод Мирового океана полиэтиленом и пла­стиковым мусором [9], на котором часто встречаются колонии бактерий, относящиеся к роду вибрионов, в том числе и патогенные для человека. Высказывается предпо­ложение, что они способствуют распространению морем инфекционных заболеваний [10], в том числе и холеры.

Особую роль в сохранении холерного вибриона в во­дных экосистемах играют хитиновые покрытия члени­стоногих, некоторых диатомовых водорослей и грибов, на поверхности которых вибрион способен существовать в виде биопленки. Хитин является вторым по распро­страненности полисахаридом на Земле [11]. Эволюционно он служит для вибрионов основным питательным субстратом, а сформированные на его поверхности био­пленки местом обитания и убежищем от неблагоприят­ных факторов окружающей среды. В результате много­численных исследований установлено, что вибрионы обладают сложным хитинолитическим комплексом, об­уславливающим утилизацию хитина в качестве источни­ка энергии, углерода и азота. Известно, что для человека биопленки могут являться средством инфицирования при употреблении загрязненной планктоном воды или необработанных морепродуктов [12].

В настоящее время метод MALDI-ToF масс-спектро­метрии активно используется в практике микробио­логических лабораторий для видовой идентификации культур микроорганизмов [13-16]. При проведении ана­лиза масс-спектров бактериальных штаммов возможно выявление пиков, характерных не только для вида, но и для определенных штаммов, что позволяет использовать метод масс-спектрометрического анализа для внутри­видового типирования [16]. Использование кластерного анализа позволяет разделять штаммы на группы, а ком­позитный индекс корреляции (СС1) — количественно определять степень родства тех или иных штаммов.

Присутствие в масс-спектрах определенных пиков может коррелировать с наличием у микроорганизмов факторов патогенности (адгезинов, токсинов, гемолизи­нов), быстрое определение наличия которых необходимо для выбора правильной тактики лечения. Разными авто­рами были получены данные, свидетельствующие о до­стоверных различиях белкового состава биопленочных и небиопленочных форм микроорганизмов родов Candida, Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus pneumoniae, V. parahaemolyticus и других [17-21].

Цель исследования — использование метода MALDI- ToF масс-спектрометрии для идентификации и срав­нительного изучения белковых спектров биопленок хо­лерных вибрионов, сформированных на биотических и абиотических субстратах.

Штаммы. В работе были исследованы штаммы V. cholerae О1, характеристика которых приведена в табл. 1. Все штаммы были получены из коллекции Музея живых культур с Центром патогенных для человека вибрионов ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора.

Питательные среды. Для культивирования штаммов использовали 1% пептонную воду (рН 7,8); 2% агар Мар­тена (рН 7,7); 0,3% агар Мартена (рН 7,7).

Субстраты. В качестве биотического субстрата ис­пользовали хитиновый экзоскелет речного рака Astacus astacus, в качестве абиотического — пластик. Субстраты нарезали пластинами 5х5 мм, помещали во флаконы с речной водой и автоклавировали при 130°С, 1,5 атм в те­чение 60 минут.

Культивирование биопленки. Из суточной агаро­вой культуры штаммов V. cholerae готовили взвесь 109 (микробных клеток/мл) мк.кл./мл. Во флаконы с 50 мл речной воды и субстратами добавляли взвесь вибрио­нов до конечной концентрации во флаконе 104 мк.кл./мл. Параллельно проводили высев на твердую питательную среду для определения КОЕ/мл. В качестве контроля все исследуемые штаммы засевали во флаконы с 50 мл реч­ной воды без субстратов. Флаконы инкубировали при комнатной температуре (t = 25 - 27°С).

На 7-е сутки культивирования биотические субстра­ты высевали методом «отпечатков» [22], высев план­ктонных образцов всех штаммов проводили по 0,1 мл на твердую питательную среду. Посевы инкубировали в те­чение 24-х часов при 37°С и использовали для проведения масс-спектрометрического анализа. В качестве контроля использовали испытуемые штаммы, хранящиеся на про­бирках с 0,3 % агаром Мартена. Для проведения масс- спектрометрии готовили взвесь 109 мк.кл./мл выросших штаммов биопленки и планктона. После этого проводили экстракцию этанолом/муравьиной кислотой. В качестве матрицы использовали а-циано-гидроксикоричную кис­лоту.

На 14-е сутки культивирования для определения возможности проведения идентификации с помощью масс-спектрометрического анализа без предварительно­го культивирования отбирали по 0,3 мл из контрольных проб. Из опытных флаконов стерильно отбирали фраг­менты хитина и пластика, трижды отмывали физиоло­гическим раствором (рН 7,2) от несвязавшихся клеток, избавлялись от излишков влаги с помощью фильтровальной бумаги и помещали в 0,3 мл дистиллированной воды. Также отбирали по 0,3 мл проб планктонных микроор­ганизмов. После чего проводили экстракцию этанолом/ муравьиной кислотой. В качестве матрицы использовали а-циано-гидроксикоричную кислоту.

Таблица / Table 1

Характеристика штаммов V. cholerae О1, использованных в работе Characteristics of strains used in this study

№№ штамма в коллекции Strain ID(Collection of Research In­stitute for Plaque Control, Rostov-on-Don, Russia)Биовар/серовар Biotype / SerotypeГенетическая характеристика Genetic characteristicОбъект, место и год выделения Source and year of isolation117917classical OgawactxА+tcpА+р. Дон, г. Ростов-на-Дону, 1999 г. water, riv. Don, Rostov-on-Don, Russia, 1999218336El Tor OgawactxА+tcpА+человек, г. Казань, 2001 г. clinical, Kazan, Russia, 20013Р-19613El Tor InabactxА+tcpА+р. Темерник, г. Ростов-на-Дону, 2014 г. water, riv. Temernik, Rostov-on-Don, Rus­sia, 20144Р-20000El Tor OgawactxА-tcpА-р. Темерник, г. Ростов-на-Дону, 2016 г. water, riv. Temernik, Rostov-on-Don, Rus­sia, 2016

MALDI-ToF-масс-спектрометрия. MALDI-ToF масс- спектрометрию проводили с использованием масс- спектрометра «Autoflex speed III Bruker Daltonics» (Германия) с программным обеспечением: FlexControl — программа для управления времяпролетными масс- спектрометрами серии flex компании Bruker; Flex Analysis 3.3 — программа для ручного анализа полученных масс- спектров (визуальное сопоставление, оценка качества масс-спектров, калибровка); Biotyper 3.1 — программа для обработки и анализа масс-спектров, полученных на масс-спектрометрах фирмы Bruker для анализа общего индекса корреляции спектров, кластерного анализа спек­тров.

Видовую идентификацию проводили с использова­нием базы белковых спектров компании Bruker. Вероят­ность соответствия исследуемого спектра к известному таксону определяется показателем Score: высокая досто­верность видовой идентификации характеризуется Score > 2,300; высокая достоверность родовой идентификации - Score от 2,299 до 2,0001.

В протоколе, рекомендуемом Bruker Daltonics, и МР 4.2.0089-14 по использованию метода MALDI-ToF масс- спектрометрии для индикации и идентификации биоло­гических агентов I - II групп патогенности необходимо предварительное выделение чистой культуры микроор­ганизмов, что требует дополнительных затрат времени. В связи с чем на первом этапе работы была оценена воз­можность идентификации штаммов холерных вибрионов путем проведения масс-спектрометрического анализа непосредственно биопленки, сформированной на биоти­ческом и абиотическом субстратах, а также планктонных форм без предварительного посева на питательные сре­ды. В работу были взяты по четыре разных варианта каж­дого штамма вибрионов — биопленка, сформированная на хитине, биопленка на пластике, планктон из флакона с хитином и планктон из флакона с пластиком. Каждое ис­следование проводили в пяти повторностях. MALDI-ToF масс-спектрометрический анализ этих образцов показал невозможность идентификации штаммов из планктон­ных проб и с пластинок хитина и пластика. Показатели Score составили менее 2,000.

Для оценки степени изменений, возникающих у хо­лерных вибрионов при формировании биопленок, про­вели высев из планктонных культур, взятых в работу штаммов V. cholerae и биопленок, сформированных на 7-е сутки культивирования. В результате идентификации культур после первого пассажа из исследуемых проб в ав­томатическом режиме все они были отнесены к виду V. cholerae c показателями Score выше 2,300.

Был проведен сравнительный анализ масс-спектров различных вариантов культур V. cholerae, полученных в результате высева планктона и биопленок (рис. 1). Все штаммы холерных вибрионов независимо от субстратов, на которых сформировалась биопленка, имели общие пики, отличающиеся по интенсивности.

Из опытных образцов штаммов наибольшим сход­ством с контрольным (рис. 1Е) обладал масс-спектр штамма биопленки вибрионов на пластинках хитина (рис. 1А). Оба образца имели пики наибольшей интен­сивности со значениями m/z 4750 ± 3, 9492 ± 4.

Сходство между масс-спектрами штаммов V. cholerae после посева образцов было изучено путем построения корреляционной матрицы в программе Biotyper 3.1 (Bruker Daltonics) (рис. 2) на основе композитного индекса корре­ляции (СО). Значения CCI, близкие к 1, свидетельствуют о высокой степени сходства спектров, значения, близкие к 0 — о четких различиях. В матрице цвет ячеек соответствует значению СО (1,0 — коричневый, далее по мере уменьше­ния оранжевый, желтый, зеленый, синий).

Как видно в корреляционной матрице, наибольшим сходством обладают варианты биопленки на хитине (цвет ячеек матрицы красный). Индекс корреляции для этих образцов составил от 0,990 до 0,894. Часть штаммов характеризовалась CCI от 0,776 до 0,402 (цвет ячеек в ма­трице от оранжевого до светло-зеленого). Большая часть матрицы окрашена в голубой и синий цвета, что свиде­тельствует о низком индексе корреляции и незначитель­ном сходстве.

С помощью программы Biotyper 3.1 на основе масс- спектрометрических профилей штаммов построена MSP-дендрограмма (рис. 3). При анализе дендрограммы отмечено, что штаммы холерных вибрионов разделились на три кластера. Культуры V. cholerae, сформировавшие биопленку на хитине, относились к одному кластеру. Среди остальных образцов какой-либо закономерности в распределении штаммов по кластерам не отмечено.

Проведенный MALDI-ToF масс-спектрометрический анализ непосредственно субстратов, а также суперна­тантов без предварительного посева на питательные среды показал невозможность идентификации штаммов V. cholerae из планктонных проб и с пластинок хитина и пластика. Показатели Score составили менее 2,000, что говорит лишь о возможной родовой идентификации. Та­ким образом, несмотря на имеющиеся в литературе дан­ные о возможности использования метода MALDI-ToF масс-спектрометрии для проведения экспресс-иденти­фикации микроорганизмов в биологических жидкостях (кровь, моча) без предварительного выделения культуры [23,24], использование данного метода для идентифи­кации биопленок V. cholerae не является достоверным и требует высева на питательные среды. В результате идентификации культур холерных вибрионов, получен­ных через 24 часа после высева биопленок и планктона, все исследуемые пробы были отнесены к виду V. cholerae c показателями Score выше 2,300, что свидетельствует о высокой достоверности определения вида.

Проведенный сравнительный анализ белковых масс- спектров штаммов V. cholerae после посева из различных образцов показал, что все штаммы независимо от суб­стратов имели общие пики, отличающиеся по интен­сивности (рис. 1). Это можно объяснить тем, что метод масс-спектрометрии позволяет проводить анализ пре­имущественно консервативных рибосомальных белков, специфичных для микроорганизмов, состав которых не зависит от условий существования.

Вместе с тем, культуры V. cholerae, выращенные на разных субстратах, имели различия в источнике пита­ния. Так вибрионы утилизируют хитин, используя его в качестве источника углерода и азота, в результате чего индуцируются хитинолитические ферменты (что несвой­ственно при культивировании на питательных средах) и это в свою очередь приводит к изменениям метаболизма, синтезу ферментов и выявлению дополнительных белко­вых пиков (рис. 1А). Об этом же свидетельствует анализ MSP-дендрограммы (рис. 3), согласно которой, штаммы, выращенные на хитине, объединились в один кластер и высокие значения индекса корреляции (CCI) для масс- спектров этих штаммов (рис. 2). Композитный индекс корреляции для составил от 0,99 до 0,894, что свидетель­ствуют о высокой степени сходства спектров.

Штаммы холерных вибрионов, которые сформирова­ли биопленку на пластике, а также планктонная форма с пластиком, имели недостаток питательных веществ, что также приводило к изменениям белкового состава за счет процесса автолиза клеток. Эти штаммы харак­теризовались низким индексом корреляции и в MSP- дендрограмме (рис. 3) были распределены по разным кластерам.

Изменения масс-спектров штаммов V. cholerae в про­цессе перехода в биопленочную форму влияют на досто­верность идентификации холерных вибрионов методом MALDI-ToF масс-спектрометрического анализа. Также необходимо учитывать тот факт, что при внесении спек­тров в базы данных используются суточные культуры, выращенные на питательных средах, и более длительное культивирование в составе биопленок может приводить к изменениям белкового спектра. Для проведения масс- спектрометрического анализа с целью идентификации культур вибрионов, находящихся в составе биопленок, необходим предварительный бактериологический высев исследуемого материала на стандартизованные питатель­ные среды. В результате сравнительного анализа белко­вых масс-спектров по величине масса / заряд и относи­тельной интенсивности пиков не было выявлено белков, характерных только для планктонных культур или био­пленок холерных вибрионов. Таким образом, показана стабильность фенотипических свойств холерного вибри­она независимо от формы его существования и высокая достоверность масс-спектрометрии для идентификации V. cholerae при соблюдении протокола исследований (вы­севе на питательные среды), независимо от формы суще­ствования в объектах окружающей среды.

Финансирование. Исследование не имело спонсор­ской поддержки.Finansing. The study did not have sponsorship.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.Conflict of interest. Authors declares no conflict of interest.

1. МР 4.2.0089-14 Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS) для индикации и идентификации возбудителей I-II групп патогенности: Методические рекомендации. – М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2015. – 19 с.